白血病的生物治疗方法

来源:中国肿瘤生物杂志 时间:2012/01/09 10:56 阅读:742
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  作者:张阳,张连生,曾鹏云,吴重阳,易良才,白俊

  [摘 要] 目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)联合同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)对急性髓细胞白血病细胞株KG-la中白血病干细胞(leukemic stem cell,LSC)的体外杀伤和诱导凋亡作用。

  方法:分离健康人外周血单个核细胞,贴壁细胞用GM-CSF和IL-4诱导培养DC,悬浮细胞用IL-2、IL-1、IFN-γ 和CD3 mAb诱导培养CIK。将KG-1a细胞冻融物作为抗原负XDC(即Ag-DC),与CIK共培养作为实验组(Ag-DC-CIK),无抗原负X的DC与CIK共培养作为对照组(DC-CIK),单独CIK作为空白对照组,与KG-1a共育后流式细胞术检测各组细胞中CD34+ CD38- CD123+白血病干细胞的比例。DC-CIK与KG-1a细胞共培养,流式细胞术检测各组细胞中KG-1a细胞与CD34+ CD38- CD123+ 细胞的凋亡率。

  结果:外周血单个核细胞成功诱导DC。CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中CD3+ CD56+细胞比例为(17.36±4.44)%、(28.22±3.66)%和(36.16±5.88)%,依次升高(P﹤ 0.05)。与对照组相比,Ag-DC-CIK组与DC-CIK组细胞中CD34+ CD38- CD123+细胞比例显著降低[(8.78±0.62)% vs(3.95±0.57)%、(3.03±0.62)%,P<0.01]。DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡,凋亡率由(2.34±0.74)%上升至(12.27±1.01)%,但对其中CD34+ CD38- CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用。结论:DC联合CIK能杀伤急性髓细胞白血病干细胞,但无明显的诱导凋亡作用。

  近年随着新药的出现和治疗方法的改进,白血病的完全缓解率和长期无病生存率已有了明显提高,但较高的复发率和多药耐药仍是目前治好白血病的主要障碍。随着对白血病研究的深入及白血病干细胞(leukemic stem cells,LSCs)概念的提出,LSCs被认为是白血病复发的主要根源,清除LSCs才有可能治疗白血病[1-2]。

  细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced cells,CIK)是一种新型的免疫活性细胞,CD3+ CD56+ T细胞是其主要效应细胞,具有强大的抗瘤活性和非MHC限制性杀瘤的优点[3]。DC与CIK细胞共培养能提高CIK细胞增殖及杀伤活性[4]。课题组前期研究[5-6]发现,DC与CIK细胞共培养对多种肿瘤细胞包括白血病细胞均有明显的杀伤作用,但DC联合CIK( DC-CIK)对LSCs的杀伤作用少有报道。

  本研究以CD34+急性髓细胞白血病细胞株KG-1a为模型,观察DC-CIK对LSCs的体外杀伤作用,为LSCs靶向治疗及临床应用DC-CIK清除残存白血病细胞提供实验基础。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料
 

  rhTNF-α购自美国Peprotech公司,rhIL-4及rh-GM-CSF由厦门特宝生物工程公司惠y,CD3抗体、rhIL-1、rhIL-2及IFN-γ均购自武汉博士德生物工程有限公司,CD80、CD83、CD14、HLA-DR、CD3、CD8、CD56、CD34、CD38抗体均为美国eBioscience公司产品,CD86、CD1a、CD123抗体购自美国BD公司, RPMI1640干粉购自美国Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司。Annexin V-FITC试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司。

  1.2 KG-1a细胞冻融抗原的制备 

  急性髓细胞白血病细胞株KG-1a购自上海拜力生物科技有限公司。收集对数生长期KG-1a细胞,生理盐水洗涤3次后,调整细胞密度为1×107/ml,置液氮中10min,取出迅速放入37℃水浴锅中,重复3次,离心后取KG-1a细胞冻融上清,经0.22μm微孔滤膜过滤,4℃保存备用。

  1.3 DC的体外诱导和培养 

  采集健康志愿者外周血12ml,常规分离外周血单个核细胞,用RPMI1640完全培养基调整细胞密度至2×106/ml,置于5% CO2、37℃培养箱中培养3h,收集贴壁细胞(同时收集悬浮细胞用于培养CIK)。加入适量RPMI1640完全培养基、100ng/ml rhGM-CSF及100ng/ml rhIL-4,隔日半量换液,每日倒置显微镜观察细胞形态变化及生长情况。培养第5天时将DC分为2组:一组加入KG-1a冻融抗原50μl(即Ag-DC),另一组加入RPMI1640完全培养基50μl,第7天两组各加入rhTNF-α50ng/ml。

  1.4 CIK的体外诱导、培养 

  取1.3中收集的悬浮细胞,调整细胞密度为1×106个/ml,加入IFN-γ1000U/ml,置于5% CO2、37℃培养箱中培养24h后,加入CD3抗体50ng/ml、rhIL-1700U/ml及rhIL-2700U/ml,每3d换液并补充rhIL-2,诱导、培养CIK,倒置显微镜观察细胞的生长情况。

  1.5 DC-CIK体外共培养 

  培养第7天将CIK分为3组:第一组为实验组,按DC:CIK为1:5加入抗原负载的DC(Ag-DC-CIK),第二组为对照组,同上述比例加入无抗原负载的DC(DC-CIK),第三组为空白对照组(CIK),继续培养CIK细胞至2天。

  1.6 流式细胞术检测DC与CIK的免疫表型 

  收集培养第8天的DC,调整细胞密度为1×106/ml,取细胞悬液200μl,加入CD80、CD83、CD86、CD1a、CD14及HLA-DR单抗。同法收集培养12d的CIK,加入CD3、CD8、CD56单抗,上机流式检测,检测结果由Cell Quest软件进行分析。

  1.7 流式细胞术检测CD34+ CD38- CD123+ 细胞比例 

  收集对数生长期KG-1a细胞,分为4组:第一组空白对照组,第二组加入Ag-DC-CIK,第三组加入DC-CIK,第四组加入CIK,作用48h后收集细胞,调整细胞密度为1×106个/ml,取细胞悬液200μl,加入CD34、CD38及CD123单抗,流式细胞仪检测各组样本中CD34+ CD38- CD123+ 白血病干细胞的比例。

  1.8 流式细胞术检测KG-1a细胞和白血病干细胞的凋亡 

  收集对数生长期的KG-1a细胞,分为4组:第一组为KG-1a凋亡检测空白对照组,第二组加入DC-CIK;第三组为LSCs凋亡检测空白对照组,第四组加入DC-CIK。24h后收集细胞,第三、四组中分别加入CD34、CD38及CD123单抗,室温避光孵育20min,PBS洗涤,重悬于结合缓冲液中,加入Annexin V 5μl,室温避光染色15min,流式细胞仪检测KG-1a细胞和LSCs的凋亡率。1.9 统计学处理 数据用 x±s表示,采用SPSS11.0软件包,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。 


  2 结 果

  2.1 DC形态学观察
 

  倒置显微镜下观察,培养天细胞为透亮小圆形,贴壁生长;培养第3天细胞体积较前稍有增大,细胞大部分呈2形,部分细胞见细小的毛刺状突起,出现小的聚集现象;培养第5天细胞体积较前明显增大,大部分细胞可见毛刺状或指状突起(图1),可见大集落样生长,部分细胞呈悬浮生长;培养第7天细胞体积无明显增大,细胞数量较前有所减少,大部分细胞呈不规r形,突起较前多且明显( 图1)。




  图1 培养5d(A)和7d(B)的DC(瑞氏染色,×1 000)

  Fig.1 DC after cultured for 5d(A)and7d(Wright staining×1 000)


  2.2 DC免疫表型分析结果 

  经流式细胞术检测培养第8天DC免疫表型显示,(67.08±4.83)%细胞表达CD1a、(61.24±8.24)%细胞表达CD83,(60.30±8.19)%细胞表达CD80,(75.41±9.21)%细胞表达CD86,(53.77±5.26)%细胞表达HLA-DR,仅(13.09±4.03)%细胞表达CD14。由此可见,外周血单个核细胞在体外经过诱导培养后分化成高纯度的成熟DC。

  2.3 DC共培养增加了CIK中CD3+ CD8+ 和CD37+ CD56+细胞的比例

  经流式细胞术检测培养2天各组CIK细胞中CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞的表达,结果显示,Ag-DC-CIK组分别为(60.49±2.56)%、(76.16±5.88)%,DC-CIK组分别为(53.02±5.18)%、(28.22±3.66)%,空白CIK组分别为(41.98±4.08)%、(17.36±4.44)%。Ag-DC-CIK组、DC-CIK组CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞比例明显高于CIK组(P<0.01),且Ag-DC-CIK组高于DC-CIK组(P<0.05,表1)。由此可见,与DC共培养的CIK其中效应细胞的比例明显高于未共培养的CIK。

1 DC共培养增加CIKCD3+ CD8+CD3+ CD56+细胞的比例(% Tab.1 Co-culture with DC increased ratio of CD3+ CD8+ and CD3+ CD56+ cells in CIK%

Group

CD3+ CD8+

CD3+ CD56+

CIK

41.98±4.08

17.36±4.44

DC-CIK

53.025±5.18*

28.22±3.66**

Ag-DC-CIK

60.49±2.56**

36.16±5.88**



< 0.05** < 0.01 vs CIK group△ P < 0.05vs DC-CIK group

  2.4 DC共培养增强CIK对CD34+ CD38- CD123+ 细胞的杀伤效应 

  流式细胞仪检测结果(表2)表明,单独CIK组、DC-CIK组、Ag-DC-CIK与KG-1a细胞共培养后,各组细胞中CD34+ CD38-CD123+细胞比例均显著低于对照组[(6.59±1.07)%、(3.95±0.53)%、(3.03±0.62)%vs(8.78±0.62)%,P<0.01],但DC-CIK组与Ag-DC-CIK组相比差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见,DC与CIK共培养后对CD34+ CD38- CD123+ 细胞的杀伤效应明显高于未共培养的CIK。

  表2 DC共培养增强CIK对CD34+ CD38- CD123+ 细胞的杀伤效应(%)

Tab.2 Co-culture with DC increased cytotoxicity of CD34+ CD38- CD123+ cells(%)


Group

CD34+ CD38- CD123+*

Control

8.78±0.62

CIK

6.59±1.07**

DC-CIK

3.95±0.53**

Ag-DC-CIK

3.03±0.62**



** P < 0.01 vs control group < 0.05 vs CIK group

  2.5 DC-CIK对KG-1a细胞及CD34+ CD38- CD123+ 细胞凋亡的影响 

  DC-CIK作用于KG-1a后,凋亡细胞由(2.34±0.74)%升至(12.27±1.01)%(P<0.01),说明DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡。DC-CIK杀伤后CD34+ CD38- CD123+中凋亡细胞仅由(3.47±0.41)%升至(4.04±0.72)%(P>0.05),说明DC-CIK不能诱导白血病干细胞凋亡(图2)。


图2 DC-CIK对KG-1a细胞及CD34+ CD38- CD123+ 细胞凋亡的影响Fig.
2 Effect of DC-CIK on apoptosis of KG-1a and CD34+ CD38- CD123+ cells
**P<0.01vs Before killing group




  


  3 讨 论 

  LSCs较g是由Lapidot和Bonnet提出[7],人急性髓细胞白血病细胞中有一群CD34+ CD38-的细胞,能够在异体移植模型中连续增殖形成白血病,而CD38+定向祖细胞没有此功能[8]。LSCs与HSC都表达CD34+ CD38-,但LSCS不表达CD117、CD90,而表达CD123[1]。

  新的的研究表明,CD34+ CD38-不再作为所有白血病患者LSCs特异性的细胞表面标志物[9]。急性髓细胞白血病LSCs对传统的放、化疗均不敏感且存在多药耐药,成为白血病复发耐药的根源[10]。LSCs的靶向治疗已成为近年的研究热点,而白血病的免疫治疗是具有较大发展潜力的抗肿瘤手段,其中CIK被认为是肿瘤过继性细胞免疫治疗的优选细胞,但细胞免疫治疗对LSCs的杀伤与凋亡作用如何少有报道。由于LSCs在体内的数量稀少,很难分离与培养,因此本实验以CD34+急性髓细胞白血病细胞株KG-1a为细胞模型,体外间接研究DC-CIK免疫治疗对LSCS的杀伤与凋亡作用。

  本实验结果显示,与CIK组相比,DC与CIK共培养后,CD3+CD8+细胞、CD3+CD56+细胞比例显著提高,Ag-DC-CIK组很高,此结果与文献报道一致[11]。对于KG-1a细胞中CD34+ CD38- CD123+细胞的杀伤作用,Ag-DC-CIK、DC-CIK组杀伤活性明显高于CIK组,提示,DC联合CIK杀瘤效应的增强可能由于DC与CIK共培养后增加二者表面分子的表达,上调IL-12、IFN-γ 等细胞因子的分泌,增强CIK的杀伤活性[12-13]。国内已有报道[14],CIK对G0期CD34+急慢性白血病细胞有明显的杀伤作用,本实验结果表明,DC联合CIK可明显降低KG-1a细胞中CD34+ CD38- CD123+细胞的比例,提示对LSCs的杀伤效应与DC的特异性杀伤和CIK的非特异性杀伤有关。

  LSCs不仅具有自我更新和无限增殖的潜能,还存在凋亡耐受,通过寻找一些诱导LSCs凋亡的途径有助于清除白血病复发耐药的根源[15-16]。目前国内外前期研究[17-18]发现,CIK对人类白血病细胞有明显的诱导凋亡作用。CIK主要通过Fas-FasL途径诱导细胞凋亡,Verneris等[19]发现,CIK细胞可对抗体内FasL阳性肿瘤细胞所引发的效应细胞活性下降,CIK可上调自身cFLIP、Bel-2、Bel-XL、DAD1及survivin等抗凋亡基因的表达,发挥抗凋亡作用。但CIK细胞是否能诱导LSCs凋亡未见报道。本实验结果显示,DC-CIK能诱导KG-1a细胞凋亡,但对其中的CD34+ CD38- CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用,其凋亡率从(3.47±0.41)%升至(4.04±0.72)%( P>0.05)。

  其中可能的机制为:CD34+ CD38-细胞表面低表达Fas[20]。有研究[21]表明, CIK细胞及其分泌的细胞因子IFN-γ 能上调部分肿瘤细胞表面Fas的表达,通过Fas-FasL途径诱导肿瘤细胞凋亡。本实验结果提示Fas的上调并不足以诱导CD34+ CD38- CD123+细胞凋亡;同时CIK具备合成FasL的能力,能抵抗肿瘤细胞引发的CIK凋亡。但有研究[22]认为,FasL可提高人骨髓中原始CD34+ CD38-l血祖细胞的存活,抑制细胞凋亡。

  综上所述,CIK作为目前肿瘤生物治疗较有发展前景的治疗手段之一,与DC共培养后可增加其靶向性和杀伤活性,对LSCs也有明显的杀伤作用,提示DC-CIK联合治疗可提高白血病的治好率,延长白血病患者的生存期。

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