多柔比星诱导白血病细胞耐药

　　【摘要】目的  观察多柔比星诱导人白血病细胞系K562产生耐药的规律，初步探讨耐药产生的机制。方法： 在设定的浓度梯度和作用时间下，用多柔比星处理K562细胞，采用RTPCR法测定mdr1基因及其他耐药相关基因的表达；运用流式细胞仪检测mdr1基因编码的P糖蛋白（Pgp）的表达水平，用免疫荧光染色检测细胞凋亡相关蛋白Survivin的表达。结果： 多柔比星在体外能诱导K562细胞产生耐药性，随着多柔比星作用浓度的增加和时间的延长，K562中mdr1及Pgp的表达逐渐上调，MRP,Topo Ⅱ,YB1和NFkappaB基因的表达亦有改变，GST则无明显变化，凋亡相关基因Survivin及其编码的蛋白在耐药产生过程中表达亦上调。结论： 多柔比星以剂量和时间依赖性方式诱导K562细胞产生耐药，多种耐药相关基因参与诱导耐药的形成，凋亡相关基因的表达改变亦是其耐药形成机制之一。

　　【关键词】  多柔比星　K562细胞　多药耐药　mdr－1基因　P糖蛋白

　　Study on mechanisms of doxorubicininduced multidrug resistance　in leukemia cell line K562

　　QIN Rujuan， XU Wenlin， ZHOU Leilei，TANG Huarong， SHEN Huiling，WANG Fachun
   
　　(Department of Central Laboratory，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang  Jiangsu 212002，China)

　　［Abstract］  Objective: To investigate doxorubicininduced multidrug resistance (MDR) in human leukemia cell line K562 and then the mechanisms of drug resistance were studied. Methods： K562 cells were treated with doxorubicin at different concentrations and times. The expression of mdr1 and other related genes were examined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Pglycoprotein (Pgp) was detected by flow cytometry (FCM) and the protein Survivin was analysed by immunofluorescence. Results： Incubation of K562 cells with doxorubicin not only induced functionally mdr1 overexpression, but also increased the expression of other genes including MRP, Topo Ⅱ, YB1, NFkappaB and Survivin. Increasing level of mdr1 mRNA correlated with its corresponding Pglycoprotein level in druginduced cells. Survivin, a member of IAP family proteins, was also high expressed after incubation of K562 cells with doxorubicin.  Conclusion： Doxorubicin can induce functional multidrug resistance overexpression in K562 cells in dose and time dependent manner, and the functional multidrug resistance may be due to the abnormal expression of genes MRP, Topo Ⅱ, YB1, NFkappaB and the antiapoptosis gene Survivin.

　　［Key words］  Doxorubicin;  K562;  MDR; mdr1 gene;  Pglycoprotein

　　白血病细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的出现是化疗失败的主要原因之一。长期以来，基础与临床工作者致力于研究白血病细胞MDR产生的机制及其逆转方法，其中mdr1基因编码的P糖蛋白（Pglycoprotein,Pgp)高表达是研究较深入的机理之一。Pgp是一个ATP依赖性药物外排泵，能利用ATP水解释放的能量主动将亲脂性药物泵出细胞外。研究发现［1］，一些人类正常细胞或组织，如肝细胞、胰腺上皮、肠黏膜、血脑脊液屏障、血生精小管屏障等，均有Pgp的表达，使得外源性药物在这些细胞或组织中的分布较低。过表达Pgp的肿瘤细胞可因细胞内药物浓度太低而产生MDR，多见于乳腺癌、膀胱癌、肺癌等患者的化疗过程中。多柔比星是临床常用化疗药物之一，属蒽环类，可直接嵌入DNA碱基之间，干扰转录过程，阻止mRNA的合成，抗瘤谱广，它能抑制DNA和RNA的合成，属周期非特异性药物。多柔比星可使K562细胞产生诱导性耐药，而且这种诱导性耐药在一定条件下可转化为组成性耐药，K562/A02 即为诱导产生的组成性耐药细胞系。本文以多柔比星作用于人白血病细胞系K562，观察多柔比星诱导细胞耐药产生的规律，初步探讨耐药形成的机制，为下一步研究耐药逆转打下基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  试剂和仪器 
   
　　RPMI 1640为Gibco公司产品，小牛血清购于杭州四季青公司，多柔比星购于Pharmacia公司，用ddH2O配制，-20℃保存。Trizol Reagent、SuperScript III FirstStrand System等试剂盒购自Invitrogen公司，Taq酶为Promage公司提供，所用引物序列均由上海生物工程有限公司合成。兔抗人多克隆抗体Survivin购自Santa Cruz公司，Cy3标记羊抗兔IgG购于Sigma公司，PE标记Pgp单克隆抗体购于BD公司。人白血病细胞K562和耐药株K562/A02分别购自中国科学院上海细胞研究所和天津血液研究所。荧光显微镜为德国Leica公司产品，流式细胞仪由BD公司生产。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞培养  K562及K562/A02在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养，每2～3天传代1次。以0.1 μg/ml多柔比星维持K562/A02细胞耐药性。
   
　　取对数生长期K562细胞（浓度为5×104 /ml），分别加入不同浓度的多柔比星（终浓度分别设为0.1, 0.5, 1.0  μmol/L），分别继续培养24 h，48 h，72 h，并设K562为阴性对照组，K562/A02为阳性对照组。收集上述细胞，各组部分细胞经PBS洗涤2次，用核荧光染料Hoechst 33342标记细胞核，4%低聚甲醛固定并4℃保存，用于免疫荧光染色检测。另一部分细胞经12 000 r/min离心5 min后去上清，-20℃保存，用于相关基因的检测。

　　1.2.2  RTPCR检测相关基因的表达  取上述-20℃保存的各组细胞，以Trizol Reagent提取总RNA，根据SuperScript Ⅲ FirstStrand System试剂盒方法合成cDNA，取等量cDNA分别以各自引物测定各组细胞中相关基因（引物序列见表1）表达量，扩增产物在含0.5 mg/L溴乙锭的1.7%琼脂糖凝胶中电泳分离，于凝胶成像仪上扫描定量，以βactin作为内参照进行质控和标化。

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　　表1  相关基因PCR引物序列表（略）

　　1.2.3  流式细胞仪检测Pgp表达  上述各组细胞经冷PBS洗涤2次，制成2×106 /ml的细胞悬液。取20 μl细胞悬液，加入PE标记Pgp单克隆抗体20 μl，室温避光孵育20 min，用PBS重悬，在保持电压补偿一致的条件下检测各组细胞相对荧光强度。

　　1.2.4  免疫荧光检测Survivin蛋白表达  取适量前述备用细胞悬液，滴于多聚赖氨酸包被载玻片，自然风干，PBS洗涤3次，0.4% Triton X100 37 ℃孵育1 h，正常羊血清（1∶5）37 ℃封闭1 h，一抗（1∶100）37℃孵育2 h，PBS洗涤3次，Cy3标记羊抗兔IgG（1∶300）37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，中性甘油封固，于荧光显微镜下观察及照相。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.5  统计分析  用SPSS10.0软件进行统计分析, 结果以均数±标准差(±s)表示, 采用方差分析和两组资料比较的t检验, P<0.05具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  多柔比星诱导性耐药的形成

　　2.1.1  mdr1基因的检测  RTPCR方法检测时效、量效组及K562、K562/A02共11例样本，实验重复3次，如图1所示，待分析样本可扩增出强度基本一致的βactin的特异性产物，表明cDNA质量良好，可用于靶基因的检测。阴性对照组无条带，阳性对照出现目的条带，当多柔比星浓度为 0.1 μmol/L时，延长药物作用时间均未出现明显目的条带；当多柔比星浓度达0.5 μmol/L，作用时间为48 h，可见mdr1阳性条带；当多柔比星浓度为1.0 μmol/L，三种作用时间均可见mdr1阳性条带。结果显示提高药物浓度及作用时间， mdr1表达可逐渐上调。
   
　　图1  多柔比星作用后mdr1表达变化（略）

　　2.1.2  Pgp的测定  随着多柔比星作用浓度和时间的增加，K562细胞膜表面Pgp表达量亦逐渐上升。如表2及图2所示，当药物作用时间为24 h，浓度为1.0 μmol/L时，与阴性对照相比，结果具有统计学意义（P<0.05）；药物作用为48 h，浓度为0. 5或0.1 μmol/L时结果出现显著差异（P<0.001）,且细胞形态均一；药物作用时间增加到72 h后，各药物浓度均可诱导Pgp明显表达，但细胞碎片较多。
   
　　(图中M1为Pgp表达阴性，M2为Pgp表达阳性)

　　图2  流式细胞仪检测不同浓度多柔比星作用48 h后Pgp表达情况（略）
   
　　表2  多柔比星不同作用后K562细胞Pgp表达情况（略）

　　与对照组相比，*:P<0.05, **:P<0.001

　　由此可见：多柔比星浓度为0.5 μmol/L，作用时间为48 h为体外诱导耐药优等条件。

　　2.2  多柔比星诱导产生耐药细胞中相关基因表达的改变
   
　　采用RTPCR方法，检测不同浓度多柔比星作用48 h后诱导产生的暂时性耐药细胞中MRP,TopoⅡ,GST。此外，我们检测了与mdr1调节相关基因YB1,NFkappaB，凋亡相关基因Survivin。由图3可见，在多柔比星作用后的诱导性耐药细胞中，随着多柔比星作用浓度增加，MRP基因表达上调，Topo Ⅱ基因表达下降，GST基因表达无明显改变。YB1，NFkappaB、Survivin表达均增加。

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　　图3  RTPCR检测相关基因表达 （略）
   
　　2.3  Survivin蛋白表达
   
　　用免疫荧光染色检测五组待检测样本（阴性对照组，阳性对照组和多柔比星作用48 h的0.1, 0.5, 1.0 μmol/L浓度组）中Survivin蛋白表达情况，分别如图4所示：Survivin主要表达于胞核，少量可于胞质内表达，且随着药物作用浓度增加，Survivin表达水平明显增加，与Survivin mRNA 变化结果一致。
   
　　图4  免疫荧光法检测Survivin蛋白表达差异性（略）
   
　　3  讨论
   
　　肿瘤细胞多药耐药性是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的其他多种抗肿瘤药也产生耐药的现象。肿瘤细胞的耐药性可分为内源性耐药与获得性耐药，后者又分为组成性耐药和暂时性耐药。暂时性耐药受多因素影响，可随着诱导药物、细胞种类、分化阶段和微环境的不同而变化，可以是某一耐药基因表达，也可以是多种耐药基因同时表达的多药耐药表型。本文以细胞毒性药物多柔比星诱导K562细胞，通过RTPCR及流式细胞仪检测到mdr1 mRNA和Pgp的表达上调，表明多柔比星作用于K562细胞后可出现耐药。 同时，我们检测结果表明，TopoⅡ,MRP基因在暂时性耐药形成过程表达量有改变，GST基因表达无明显变化。
   
　　mdr1是一种应激应答基因，环境的改变能调节它的活性。有报道［2,3］表明，热休克，外科损伤，以及显露于致癌物、化疗药物、UV和X射线等均能使其表达上调。我们的实验结果证实细胞毒性药物可上调mdr1和Pgp的表达，且这种上调具有时间和剂量依赖性。
   
　　目前较为公认的参与MDR 形成的机制有MRP，GST，TopoⅡ基因的异常表达。研究显示DNA拓扑异构酶（Topo）可催化DNA 的断裂再连接反应，参与DNA 的复制、转录、重组和修复，是许多化疗药的作用靶点。化疗药与DNA形成“可切复合物”，若DNA拓扑异构酶活性下降，将导致耐药的产生［4］。MRP基因亦属于ATP结合盒式载体基因超家族中的一员，位于6号染色体上，编码一种细胞内转运蛋白，约190 kD，含1531个氨基酸，主要位于内质网上，其介导的药物外排与谷胱甘肽（GSH）有关。MRP基因表达上调，可促进药物与GSH结合物的外排增加而导致细胞耐药。
   
　　我们实验结果表明：多柔比星诱导K562细胞所产生的暂时性耐药是由多种耐药基因共同参与而形成的。许多实验结果显示，K562细胞对多柔比星耐药主要是由Pgp过表达这一机制介导，本实验观察到多柔比星作用K562细胞后Pgp表达增加，与Yague［5］等人研究结果不一致。此外，我们着重研究mdr1基因及Pgp表达增加的具体机制，检测YB1,NFkappaB,凋亡相关基因Survivin及其编码的蛋白，结果表明以上基因和蛋白表达明显改变。

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　　YB1是冷休克蛋白家族成员之一，其结构中高保守的冷休克区（CSD）可识别多种基因启动子区的反向CCAAT盒，即Y盒，并与之特异性地结合，调控基因的转录与转译。真核生物的YB1 蛋白参与多种生物过程，包括DNA修复，细胞增殖，细胞周期，耐药及基因的转录转译调节。YB1主要分布于细胞胞质，当细胞受到外界的各种不良刺激后，细胞活化，细胞中的YB1出现过度表达，从胞质易位至胞核。Ulrike Stein［6］等发现，高温可诱导YB1从胞质向核内易位。现有的研究证明，mdr1基因的转录调控机制复杂。与其他绝大多数缺乏TATA盒的基因相似，人mdr1基因在其调控区具有一个CCAAT反向元件(-79～-75，Y－盒)，而易位入核的YB1结构中的CSD可识别并结合该元件，从而调控mdr1基因的转录及表达。
   
　　此外，抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时可激活NFkappaB。Bentires［7］等发现，NFkappaB通过引起mdr1基因表达的增加而介导细胞耐药，并证实在mdr1基因启动子的第一个外显子区域存在NFkappaB的结合位点,提示mdr1基因可能是NFkappaB的下游基因。Sanjeev Shukla等［8］研究表明：Apigenin可抑制人前列腺癌细胞系PC3中组成性和诱导性NFkappaB的表达,从而促进PC3的凋亡。因此，阻断NFkappaB活性可能成为基因治疗肿瘤的一个新方向。
   
　　Survivin是近年发现的凋亡抑制蛋白IAP家族的新成员,是迄今为止发现的作用较强的凋亡抑制基因，其羧基端有一40个氨基酸组成的α螺旋结构。在有丝分裂初期,Survivin可通过α螺旋与纺锤体微管特异性结合，抑制caspase活性，从而降低凋亡的发生［9］。Survivin还可通过诱导TNF受体介导的信号转导中NFkappaB的活化而发挥抗凋亡作用［10］。因此，我们认为YB1和NFkappaB在多柔比星诱导K562细胞产生耐药过程中也同时被活化，并通过各自作用途径参与了mdr1 mRNA和Pgp的表达上调。此外，Survivin作为抗细胞凋亡蛋白之一，在诱导耐药过程中表达上调，表明凋亡减少亦是耐药形成的机制之一。在今后的工作中，我们将继续探讨上述几种基因之间的相互作用及其在肿瘤耐药形成中的具体机制,为临床有效逆转或预防肿瘤耐药寻找新的作用靶点。

　　【参考文献】

　　［1］ Scotto KW, Johnson RA. Transcription of the multidrug resistance gene mdr1: a therapeutic target［J］. Mol Interv,2001,1(2):117-125.

　　［2］ Abolhoda A, Wilson AE, Ross H, et al. Rapid activation of mdr1 gene expression in human metastatic sarcoma after in vivo exposure to doxorubicin［J］. Clin Cancer Res,1999,5(11):3352-3356.

　　［3］ Hu Z, Jin S, Scotto KW. Transcriptional activation of the mdr1 gene by UV irradiation［J］. J Biol Chem,2000,275(4):2979-2985.

　　［4］ Allen KA, Williams AO, Isaacs RJ, et al. Downregulation of human Topoisomerase II alpha correlates with altered expression of transcriptional regulators NFYA and Sp1［J］. Anticancer Drugs,2004,15(4): 357-362.

　　［5］ Yague E, Armesilla AL, Harrison G, et al. Pglycoprotein (MDR1) expression in leukemic cells is regulated at two distinct steps,mRNA stabilization and translational initiation［J］. J Bio Chem,2003,278(12):10344-10352.

　　［6］ Ulrike S, Karsten JR, Wolfgang W, et al. Hyperthermiainduced nuclear translocation of transcription factor YB1 leads to enhanced expression of multidrug resistancerelated ABC transporters［J］. J Biol Chem,2001,276(30):28562-28569.

　　［7］ Bentires JM, Barbu V, Fillet M, et al. NFkappaB transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells［J］. Oncogene,2003,22(1): 90-97.

　　［8］ Shukla S, Gupta S. Suppression of constitutive and tumor necrosis factor alphainduced nuclear factor (NF)kappaB activation and induction of apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma PC3 cells: correlation with downregulation of NFkappaBresponsive genes［J］. Clin Cancer Res,2004,10(9):3169-3178.

　　［9］ Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An antiapoptotic protein human Survivin is a direct inhibitor of caspase3 and 7［J］. Biochemistry,2001,40(4):1117-1123.

　　［10］ Holleman A, Boer ML, Menezes RX, et al. The expression of 70 apoptosis genes in relation to lineage, genetic subtype, cellular drug resistance, and outcome in childhood acute lymphoblastic［J］. Blood, 2006,107(2):769-776.

　　［本文编辑］ 汪玉芳


　　［基金项目］ 江苏省卫生重大课题基资助项目（K2005017）