小鼠肺癌细胞B7分子的构建
来源：医生在线网
时间：2009/09/03 13:29
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摘 要：
目的 改善肿瘤细胞B7分子表达。
方法 将小鼠ALA9702肺癌细胞与活化的B淋巴细胞用PEG进行细胞融合，经ELISA及免疫细胞化学筛选后，观察了融合细胞的体外生长曲线，并用S-P免疫细胞化学染色观察了融合细胞的肺癌抗原及B7分子的表达。
结果 经筛选获得1株融合细胞FLB2C，既表达肺癌抗原又表达B7分子，该细胞在体外培养中贴壁性减弱，生长变慢。
结论 通过细胞融合方法可以有效改善肿瘤细胞的B7分子表达，从而提高肿瘤细胞的抗原性，为制备更有效的肿瘤疫苗奠定了基础。
中图分类号：R73文献标识码：A
Establishment of mouse lung cancer fusion
cell expressing B7 mole-cules
LIN Ping，LU Yan-rong，ZHANG Jie，HUANG Xiao-zhong
（Institute of Cancer Research and Center Oncology，the First Affiliated Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041，China）
Abstract：Objective To ameliorate expression B7 molecular of tumor cell．Methods Mouse lung cancer cell ALA9702 and active B lymphocyte were fused by PEG．After screening with ELISA and immunocytochemistry，growth curve of the fusion cells were observed in vitro．The expression of lung cancer antigen and B7 molecular in the fusion cells were monitored by S-P immunocytochemistry stain．Results One fusion cell line FLB2C has been obtained through screening．FLB2C can give expression to lung cancer antigen and B7 molecular．In vitro culture，the attach wall characteristic of FLB2C are abate and growth of FLB2C are slower．Conclusion These results proved that expression of B7 molecular in humor cell could be availability ameliorated with cell fusion，antigenicity of tumor cell would be improved．
Key words：lung cancer fusion cell；expression of B7 molecules；establishment
近年来，对肿瘤疫苗的研究成为了肿瘤免疫治疗的一个热点。以往的疫苗细胞不能十分有效刺激机体产生保护性免疫反应的一个重要原因之一是肿瘤细胞多数低表达或不表达B7分子［1］，即缺乏了T细胞免疫应答所需的共刺激信号。如何改善肿瘤细胞的共刺激分子表达以达到提高肿瘤免疫原性，亦成为疫苗研制的重要问题。本文研究了将小鼠ALA9702肺癌细胞与活化的B淋巴细胞融合，并观察到融合细胞既能表达肺癌抗原又能表达B7分子。
1 材料与方法
1.1 材料 HAT培养液（Sigma产品）：用含15％小牛血清的1640培养液制成终浓度为次黄嘌呤（H）1×10－4mol、氨基喋呤（A）4×10－7mol、胸腺嘧啶（T）1.6×10－5mol。RPMI1640培养液（Gibco BRL USA）：含15％小牛血清、100μg／ml青霉素、100μg／ml链霉素。聚乙二醇（PEG）：分子量4 000Merck产品，使用浓度为50％。MAb B7购自Parmagen公司。LPS购自Difco公司。ALA9702细胞：由本室建立的HGPRT缺陷的小鼠LA795肺癌细胞株ALA9702［2］，常规培养于1640培养液中。兔抗ALA9702抗体（RαA）和兔抗小鼠活化B淋巴细胞抗体（RαB）由本室按常规方法制备。
1.2 小鼠活化的B淋巴细胞的制备 昆明小鼠用人血清白蛋白（10μg／kg体重）腹腔注射，14d后，取小鼠脾细胞分离B淋巴细胞后，用LPS（17μg／ml）刺激培养3d，收集其细胞制成细胞悬液作融合用。
1.3 细胞融合 ALA9702细胞与小鼠活化的B淋巴细胞以1∶10比例混合，50％PEG融合后，用HAT培养液37°C 5％ CO2培养于96孔板中，10d时，对照ALA9702细胞死亡，换用HT培养液培养1周，再用1640培养液常规培养，用RαA和RαB抗体通过ELISA法测定上清中相应的反应值进行初筛，选择二者反应均高（OD值高）孔且生长良好细胞，扩增后作有限稀释克隆，进一步用Mab B7 S-P免疫细胞化学染色筛选法选择强阳性细胞扩增，冻存备用。
1.4 S-P免疫细胞化学 将细胞悬液制成细胞涂片，用丙酮4°C固定10min，1％ BSA封闭后，滴加MAb B7 5μg／ml，4°C过夜，按常规进行S-P免疫化学染色，显色后，光镜下观察、以显棕黄色为阳性反应。
1.5 融合细胞的体外生长性质 光镜下观察细胞形态，常规台盼兰排染法计 数，绘制生长曲线。
1.6 融合细胞肺癌抗原及B7分子的表达 融合细胞增殖传代后，制成涂片，分别用RαA、MAb B7进行上述S-P免疫细胞化学染色。
2 结果
2.1 融合细胞的建立 经由ALA9702和活化的小鼠B淋巴细胞融合后，由RαA和RαB筛选出15孔反应强、生长良好的细胞，进一步克隆后用MAb B7选择一株反应较强的细胞，命名为FLB2C。
2.2 FLB2C和ALA9702细胞生长曲线 ALA9702和FLB2C细胞生长曲线见图1，图中显示FLB2C细胞生长较ALA9702细胞明显缓慢。
Fig1 Growth curves of FLB2C and ALA9702
a：FLB2C；
b：ALA9702
2.3 融合的细胞形态 融合细胞呈圆形，为半贴壁生长而贴壁性细胞轻摇即可掉下，而ALA9702细胞亦为半贴壁生长，细胞在传代后期大部份呈短梭形状，贴壁更紧密。
2.4 细胞肺癌抗原及B7分子的表达 S-P免疫细胞化学显示ALA9702细胞仅表达肺癌抗原，不表达B7分子，而FLB2C细胞则既表达肺癌抗原、又表达B7分子，B7分子主要分布在细胞膜及细胞浆。FLB2C细胞表达B7结果显示见图2。
图2 FLB2C细胞Mab B7 S-P免疫细胞化学染色×40
Fig2 Mab B7 S-P immunocytochemistry of FLB2C cells
3 讨论
T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制，随着人们对抗原的识别和提呈，T细胞激活等免疫应答机理认识的不断深入，认为有效的抗肿瘤免疫反应必需在共刺激信号的参与下，将肿瘤抗原多肽提呈给T细胞而激发T细胞的免疫应答［3］，B7是共刺激分子中较重要的，而大多数肿瘤细胞缺乏或低表达B7，而导致不能诱导有效的抗肿瘤免疫应答，这可能是肿瘤逃逸免疫监视的重要原因之一。
我们选用不表达B7分子的小鼠ALA9702肺癌细胞与活化的B淋巴细胞融合，获得了既能表达B7分子又有肺癌抗原表达的融合细胞，证实通过融合确能将共刺激分子B7导入肿瘤细胞，改善了肿瘤细胞上缺乏B7分子的状态，将可能达到有效激活T细胞免疫。GUO等［4］亦报道将大鼠的肝癌细胞与BSA活化的B淋巴细胞融合，获得阳性表达MHC、B7、ICAM-1等的杂交细胞、并能有好的免疫预防肝癌的效果。
该方法简便，并且能将正常细胞的其他共刺激分子融合到肿瘤细胞，将会比单一基因导入更有效。在筛选过程中，要注意反复筛选，因B7分子与细胞膜结合较紧，不易脱落，故要在细胞上检测到B7分子的表达，才能确定是否真正具有B7分子的表达。
研究发现，正常细胞与肿瘤细胞融合，可将正常细胞信息导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞生长趋向正常细胞方向分化。我们研究获得的细胞在体外培养过程发现其形态及生长性质有所改变，生长呈缓慢趋势，初步结果说明通过正常细胞与肿瘤细胞融合后，可能改变亲代肿瘤细胞一些生长性质，由此构建的融合细胞有可能的应用价值。
基金项目：卫生部资助项目（96-1-236）
作者简介：林苹（1963-），女，四川人，副研究员，硕士，主要从事肿瘤疫苗的研究。
参考文献：
［1］GORDON JF，ARONLD SF，JEFFREY MS，et al．B7，a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplostic B cells［J］．J Immunol，1989，143（8）：2714～2717．
［2］林 苹，陆燕蓉，周宏远，等.一株HGPRT缺陷型小鼠肺癌细胞及其生物学性质［J］．肺癌杂志，1999，2（1）：5～8．
［3］CHEN L，LINSLEY PS，HELLSTROM KE．Costimulatinos of T cells for tumor immunity［J］．Immunol Today，1993，14：483～486．
［4］GUO Y，WU M，CHEN H．Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells ［J］．Science，1994，263：518～520．
目的 改善肿瘤细胞B7分子表达。
方法 将小鼠ALA9702肺癌细胞与活化的B淋巴细胞用PEG进行细胞融合，经ELISA及免疫细胞化学筛选后，观察了融合细胞的体外生长曲线，并用S-P免疫细胞化学染色观察了融合细胞的肺癌抗原及B7分子的表达。
结果 经筛选获得1株融合细胞FLB2C，既表达肺癌抗原又表达B7分子，该细胞在体外培养中贴壁性减弱，生长变慢。
结论 通过细胞融合方法可以有效改善肿瘤细胞的B7分子表达，从而提高肿瘤细胞的抗原性，为制备更有效的肿瘤疫苗奠定了基础。
中图分类号：R73文献标识码：A
Establishment of mouse lung cancer fusion
cell expressing B7 mole-cules
LIN Ping，LU Yan-rong，ZHANG Jie，HUANG Xiao-zhong
（Institute of Cancer Research and Center Oncology，the First Affiliated Hospital，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041，China）
Abstract：Objective To ameliorate expression B7 molecular of tumor cell．Methods Mouse lung cancer cell ALA9702 and active B lymphocyte were fused by PEG．After screening with ELISA and immunocytochemistry，growth curve of the fusion cells were observed in vitro．The expression of lung cancer antigen and B7 molecular in the fusion cells were monitored by S-P immunocytochemistry stain．Results One fusion cell line FLB2C has been obtained through screening．FLB2C can give expression to lung cancer antigen and B7 molecular．In vitro culture，the attach wall characteristic of FLB2C are abate and growth of FLB2C are slower．Conclusion These results proved that expression of B7 molecular in humor cell could be availability ameliorated with cell fusion，antigenicity of tumor cell would be improved．
Key words：lung cancer fusion cell；expression of B7 molecules；establishment
近年来，对肿瘤疫苗的研究成为了肿瘤免疫治疗的一个热点。以往的疫苗细胞不能十分有效刺激机体产生保护性免疫反应的一个重要原因之一是肿瘤细胞多数低表达或不表达B7分子［1］，即缺乏了T细胞免疫应答所需的共刺激信号。如何改善肿瘤细胞的共刺激分子表达以达到提高肿瘤免疫原性，亦成为疫苗研制的重要问题。本文研究了将小鼠ALA9702肺癌细胞与活化的B淋巴细胞融合，并观察到融合细胞既能表达肺癌抗原又能表达B7分子。
1 材料与方法
1.1 材料 HAT培养液（Sigma产品）：用含15％小牛血清的1640培养液制成终浓度为次黄嘌呤（H）1×10－4mol、氨基喋呤（A）4×10－7mol、胸腺嘧啶（T）1.6×10－5mol。RPMI1640培养液（Gibco BRL USA）：含15％小牛血清、100μg／ml青霉素、100μg／ml链霉素。聚乙二醇（PEG）：分子量4 000Merck产品，使用浓度为50％。MAb B7购自Parmagen公司。LPS购自Difco公司。ALA9702细胞：由本室建立的HGPRT缺陷的小鼠LA795肺癌细胞株ALA9702［2］，常规培养于1640培养液中。兔抗ALA9702抗体（RαA）和兔抗小鼠活化B淋巴细胞抗体（RαB）由本室按常规方法制备。
1.2 小鼠活化的B淋巴细胞的制备 昆明小鼠用人血清白蛋白（10μg／kg体重）腹腔注射，14d后，取小鼠脾细胞分离B淋巴细胞后，用LPS（17μg／ml）刺激培养3d，收集其细胞制成细胞悬液作融合用。
1.3 细胞融合 ALA9702细胞与小鼠活化的B淋巴细胞以1∶10比例混合，50％PEG融合后，用HAT培养液37°C 5％ CO2培养于96孔板中，10d时，对照ALA9702细胞死亡，换用HT培养液培养1周，再用1640培养液常规培养，用RαA和RαB抗体通过ELISA法测定上清中相应的反应值进行初筛，选择二者反应均高（OD值高）孔且生长良好细胞，扩增后作有限稀释克隆，进一步用Mab B7 S-P免疫细胞化学染色筛选法选择强阳性细胞扩增，冻存备用。
1.4 S-P免疫细胞化学 将细胞悬液制成细胞涂片，用丙酮4°C固定10min，1％ BSA封闭后，滴加MAb B7 5μg／ml，4°C过夜，按常规进行S-P免疫化学染色，显色后，光镜下观察、以显棕黄色为阳性反应。
1.5 融合细胞的体外生长性质 光镜下观察细胞形态，常规台盼兰排染法计 数，绘制生长曲线。
1.6 融合细胞肺癌抗原及B7分子的表达 融合细胞增殖传代后，制成涂片，分别用RαA、MAb B7进行上述S-P免疫细胞化学染色。
2 结果
2.1 融合细胞的建立 经由ALA9702和活化的小鼠B淋巴细胞融合后，由RαA和RαB筛选出15孔反应强、生长良好的细胞，进一步克隆后用MAb B7选择一株反应较强的细胞，命名为FLB2C。
2.2 FLB2C和ALA9702细胞生长曲线 ALA9702和FLB2C细胞生长曲线见图1，图中显示FLB2C细胞生长较ALA9702细胞明显缓慢。
Fig1 Growth curves of FLB2C and ALA9702
a：FLB2C；
b：ALA9702
2.3 融合的细胞形态 融合细胞呈圆形，为半贴壁生长而贴壁性细胞轻摇即可掉下，而ALA9702细胞亦为半贴壁生长，细胞在传代后期大部份呈短梭形状，贴壁更紧密。
2.4 细胞肺癌抗原及B7分子的表达 S-P免疫细胞化学显示ALA9702细胞仅表达肺癌抗原，不表达B7分子，而FLB2C细胞则既表达肺癌抗原、又表达B7分子，B7分子主要分布在细胞膜及细胞浆。FLB2C细胞表达B7结果显示见图2。
图2 FLB2C细胞Mab B7 S-P免疫细胞化学染色×40
Fig2 Mab B7 S-P immunocytochemistry of FLB2C cells
3 讨论
T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制，随着人们对抗原的识别和提呈，T细胞激活等免疫应答机理认识的不断深入，认为有效的抗肿瘤免疫反应必需在共刺激信号的参与下，将肿瘤抗原多肽提呈给T细胞而激发T细胞的免疫应答［3］，B7是共刺激分子中较重要的，而大多数肿瘤细胞缺乏或低表达B7，而导致不能诱导有效的抗肿瘤免疫应答，这可能是肿瘤逃逸免疫监视的重要原因之一。
我们选用不表达B7分子的小鼠ALA9702肺癌细胞与活化的B淋巴细胞融合，获得了既能表达B7分子又有肺癌抗原表达的融合细胞，证实通过融合确能将共刺激分子B7导入肿瘤细胞，改善了肿瘤细胞上缺乏B7分子的状态，将可能达到有效激活T细胞免疫。GUO等［4］亦报道将大鼠的肝癌细胞与BSA活化的B淋巴细胞融合，获得阳性表达MHC、B7、ICAM-1等的杂交细胞、并能有好的免疫预防肝癌的效果。
该方法简便，并且能将正常细胞的其他共刺激分子融合到肿瘤细胞，将会比单一基因导入更有效。在筛选过程中，要注意反复筛选，因B7分子与细胞膜结合较紧，不易脱落，故要在细胞上检测到B7分子的表达，才能确定是否真正具有B7分子的表达。
研究发现，正常细胞与肿瘤细胞融合，可将正常细胞信息导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞生长趋向正常细胞方向分化。我们研究获得的细胞在体外培养过程发现其形态及生长性质有所改变，生长呈缓慢趋势，初步结果说明通过正常细胞与肿瘤细胞融合后，可能改变亲代肿瘤细胞一些生长性质，由此构建的融合细胞有可能的应用价值。
基金项目：卫生部资助项目（96-1-236）
作者简介：林苹（1963-），女，四川人，副研究员，硕士，主要从事肿瘤疫苗的研究。
参考文献：
［1］GORDON JF，ARONLD SF，JEFFREY MS，et al．B7，a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplostic B cells［J］．J Immunol，1989，143（8）：2714～2717．
［2］林 苹，陆燕蓉，周宏远，等.一株HGPRT缺陷型小鼠肺癌细胞及其生物学性质［J］．肺癌杂志，1999，2（1）：5～8．
［3］CHEN L，LINSLEY PS，HELLSTROM KE．Costimulatinos of T cells for tumor immunity［J］．Immunol Today，1993，14：483～486．
［4］GUO Y，WU M，CHEN H．Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells ［J］．Science，1994，263：518～520．
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