肿瘤过继细胞治疗

　　作者：钱其军，吴孟超 

　　［摘 要］  肿瘤过继细胞治疗（adoptive cell therapy，ACT）较早被提出并一度盛行，但长期以来其疗效不佳，逐渐淡出人们视野。近年来，肿瘤ACT取得长足进步，利用T细胞过继免疫治疗黑素瘤获得令人鼓舞的成功；利用细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK）治疗癌症也在我国兴起，并取得可喜成绩。在肿瘤ACT领域，仍面临选择什么样的效应细胞、如何效果很好诱导筛选T细胞克隆、是否采用T细胞TCR转基因技术、如何通过武装化T细胞提高疗效、如何评判肿瘤ACT疗效等方面的问题。

　　1007-385X（2010）01-0001-06 肿瘤过继细胞治疗（adoptiveceltherapy，ACT）是免疫疗法的一种，通过对自体免疫细胞进行体外激活和扩增，然后将其重新输回肿瘤患者体内，并辅以合适的生长因子，促使其在体内发挥杀伤肿瘤细胞的作用。自1985年Rosenberg等［1］首先应用ACT方法治疗黑素瘤以来，肿瘤ACT虽有进展，但一直成效不佳。而在我国，1990年左右曾一度兴起应用淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK）治疗肿瘤的热潮，但终因该方法涉及大剂量IL-2的使用，毒性较大，且临床疗效不明确，逐渐退出临床治疗，目前现有少数单位继续应用。这些状况使肿瘤ACT陷入“骗局还是希望”的彷徨中，没有成为癌症治疗的主流方法［2］。

　　近年来，肿瘤ACT取得长足进步，Rosenberg利用T细胞过继免疫治疗黑素瘤获得令人振奋的成果［3］；国内越来越多的单位开展起细胞因子诱导杀伤细胞（cy-tokine induced killer cell，CIK）的华体会手机娱乐 ，并获得了可喜的治疗效果。在本文中，笔者将就肿瘤ACT的发展历程、发展状况与存在问题作一探讨。

　　1.肿瘤ACT的发展历程 

　　1985年，美国国立癌症研究所的Rosenberg教授首先将LAK细胞引入黑素瘤的治疗，利用患者自身的防疫系统来治疗癌症，开创了肿瘤ACT的历史［1］。3年后他又建立了肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）对黑素瘤的治疗方法［4］。在我国，1990年左右曾兴起应用LAK治疗肿瘤的热潮，但该方法涉及大剂量IL-2的使用，毒性较大，且LAK细胞体外扩增能力较低，体内杀瘤活性不高，故逐渐退出临床治疗。

　　肿瘤ACT所面临的困境使其陷入“骗局还是希望”的彷徨中，甚至有质疑者认为癌细胞是患者自身的，机体怎么会把这些癌细胞看作外来入侵者呢？2007年，来自马里兰州的Johns Hopkins大学肿瘤学家Bert Vogelstein和其同事在Science杂志报道，称乳腺癌和结肠癌细胞中含有数百个基因的突变。后续研究进一步证实了这个观点：癌细胞群中确实存在基因突变，从而使肿瘤组织中出现在机体其他部位所没有的新抗原，这些新抗原会引起机体免疫反应［5］。

　　新型抗体的研究成果进一步证实了上面的观点，这种新型抗体与传统的作用于肿瘤表面抗体的机制不同，它们直接作用于T细胞，通过增强或延长激活T细胞而发挥抗癌作用。2010年8月，Medare曾生物技术公司宣布了该公司研发的针对免疫应答天然抑制蛋白——细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的抗体ipilimumab治疗黑素瘤的Ⅲ期临床试验报告，接受ipilimumab治疗的676例患者平均生存时间为10个月，而对照组现有6.4个月，有近25%的患者活了2年以上。这是国际上首先报道对四期黑素瘤患者仍有疗效的治疗方法［3，6］。针对另一个免疫应答抑制蛋白——程序性死亡因子（PD-1）的抗体研究也取得相似的结果。临床试验表明，PD-1抗体对将近三分之一的黑素瘤和肾癌患者有疗效，治疗后长达3年的时间里，有反应的患者无一例复发；虽然有很多患者体内依然存有肿瘤，但一直处于静止状态，没有继续生长［7］。这两种抗体的临床试验表明，通过激活患者体内自身的免疫系统，能有效对抗肿瘤。制药巨头Bristol-Myers Squibb公司以24亿美元高价收购了拥有这两个抗体的Medarex公司。2010年，FDA批准了以免疫细胞树突状细胞（DC）为基础的肿瘤疫苗Provenge用于前列腺癌的治疗［3，8］。

　　这一系列研究成果使肿瘤ACT重现曙光，打消了“骗局还是希望”的彷徨。2002年，Rosenberg教授等［9］提出治疗前免疫耗尽预处理策略，将ACT治疗效率显著提升。随后他付出了艰辛的努力，逐渐使黑素瘤ACT慢慢走向成功［10-12］。在较近的临床试验中［3］，93个坚持治疗的转移性黑素瘤患者中，有20个患者经历了癌症痊愈的全过程，19个患者活了3~8年的无癌症生活，另有32个患者体内的肿瘤明显变小。如此好的治疗效果在全身转移性肿瘤患者中堪称闻所未闻，揭示了肿瘤ACT的巨大威力。在我国，越来越多的单位开展起CIK的肿瘤临床治疗，也展现了可喜的治疗效果。我们有理由相信，肿瘤ACT即将迎来新一轮的研究高潮，未来有可能在华体会手机娱乐 中占据相当重要的地位。

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　　2 肿瘤ACT的现状与存在问题的思考

　　肿瘤ACT包括效应细胞分选、体外扩增、体外处理、回输治疗等步骤。总的来说，效应免疫细胞的产生主要依赖于特异性肿瘤抗原的刺激、细胞因子和共刺激分子的作用以及基因工程技术的应用等。高免疫活性、长期体内存活效应细胞的获取与效果很好富集是肿瘤ACT成功的关键。

　　2.1 效应细胞的选择

　　国内国外不同的做法 肿瘤ACT采用的效应细胞可分为两类，第一类包括LAK、CIK及自然杀伤细胞（NK），这类细胞可从外周血中分离，并经淋巴因子或细胞因子诱导刺激获得，可通过非MHC依赖性发挥抗肿瘤作用。LAK由于涉及大剂量IL-2的使用，毒性较大，目前已很少采用。

　　CIK细胞在我国肿瘤ACT中较为流行，在当前的技术条件下，通过采血及2周的体外扩增培养，很容易获得1×1010以上的CIK细胞，操作相当简便，技术较为成熟稳定。国内有上百家医院开展了CIK的临床治疗，屡有报道其效果显著［13-15］，CIK治疗不仅抑制了肿瘤生长也提高了肿瘤患者的生存质量。但国际上应用CIK的临床研究相对较少。特别值得指出的是国内有些单位仅用≤1×109的CIK细胞对肿瘤进行临床治疗，虽然不同的培养体系培养的CIK的质量并不相同，但输注相当数量CIK细胞对抗肿瘤疗效仍十分重要，理论上≤1×109的CIK细胞输注不足以产生明显抗肿瘤疗效。

　　另一类效应细胞为肿瘤抗原特异性T细胞，包括TIL、细胞毒性T细胞（ cytotoxic T lymphocyte，CTL），两者均为被肿瘤抗原激活的细胞毒T细胞，识别自身MHC类分子抗原复合物，具有高度特异性杀伤性能。由于其疗效明显，在国际上临床研究较多。要获得足够量的T细胞，其技术体系相对较为复杂，细胞诱导培养周期较长，培养成功率相对较低。较近美国国立癌症研究所的Rosenberg教授做了大量改进工作，简化了培养技术及大大提高了成功率，现正尝试从患者血液中直接提取T细胞并基因改l，从而使这些T细胞能识别肿瘤抗原［16-17］。

　　2.2 T细胞克隆的诱导筛选

　　体外培养或体内存活的艰难抉择 在进行T细胞治疗时，人们总是希望通过筛选或激活以获得特异性靶向肿瘤细胞且具有高杀伤性的T细胞克隆种子。一种策略是先通过克隆化培养，富集多个候选克隆，通过对自体肿瘤细胞与异体肿瘤细胞杀伤活性或干扰素γ 表达量的比较，确定优等T细胞克隆，进行扩大培养。另外一种策略是将具有特定肿瘤抗原呈递能力的DC细胞与原始T细胞共培养，富集具有特定肿瘤抗原特异性的T细胞。

　　上述两种方法培养获得的T细胞未经任何转基因修饰，为天然状态，安全性高。然而，从很多T细胞中筛选一个对于肿瘤高反应性的细胞克隆，再把这个克隆扩增至临床所需的1×109~1×1011治疗剂量细胞数，这个过程较少需要45d。对于肿瘤患者来说无疑是一个焦急的等待过程，有些患者可能都等不到治疗就已死亡。另一方面，该方法面临如何权衡体外培养与体内存活时间的难题：体外培养的时间长，细胞会容易变老，活力下降、干性丢失，获得多为分化终末期细胞，在体外虽能显示治疗效果，但输入患者体内后，细胞在体内存活时间较短，治疗效果将受影响［18-19］。具有中心记忆细胞的CCR7+，CD27+，CD28+，CD62L+表型的抗瘤T细胞会比丢失了这些标记的高度分化T细胞更有效［19-21］，在治疗有效患者中可以见到长期存在过继输注的T细胞，该细胞表型为CD27+CD28+［21，22］。

　　较近Dudley博士等［23］研究表明，年轻的TIL细胞对华体会手机娱乐 效果更好。其次，T细胞克隆到底是单克隆好还是多克隆好？肿瘤是一个异质性群体，表面抗原不一致，因此在T细胞筛选克隆时，如果过于强调单细胞克隆，或许疗效并不理想［19］。再则，针对肿瘤特异性抗原（ 如p53，CEA）的T细胞克隆也会产生毒性作用，主要由于部分细胞抗原表达的缺失以及部分非靶标的过激反应。

　　另外，获得能在体内长时间存活的T细胞克隆非常重要。Berger博士等报道，在一个CMV感染的灵长目动物模型中，只有中枢记忆性T细胞衍生的抗原特异的CD8克隆在体内持续存在很长时间，并接近记忆性T细胞的生存时间［24］。其他研究显示，诱导Wnt-beta-catenin表达可促进增殖和抗肿瘤能力增强的记忆性“干”细胞的产生，这些细胞比其他T细胞亚群在过继治疗中更有效。在另一项研究中，针对EBV的CTL，主要是效应性T细胞，含有CD4和CD8阳性细胞群，能够在体内存在长达9年之久，持续地发挥抗E月V淋巴瘤的作用［24］。

　　因此，针对肿瘤过继免疫治疗，T细胞克隆的筛选所带来的利与弊值得我们关注，能否寻找到一种既能快速筛选T细胞克隆又能使其在体内长期存活的方法至关重要。笔者实验室与上海白泽生物技术有限公司合作开发了能产生肿瘤抗原特异性免疫反应的淋巴细胞活化技术（ lymphocyte activation for antigen-specific responses，LARs）。通过建立不同肿瘤抗原的饲养细胞库，通过强化患者自身肿瘤细胞抗原及第二刺激信号，对如何效果很好获得针对肿瘤细胞特征的T细胞克隆、并快速且能保持T细胞干性的方法进行了探索，取得了初步成功。

　　2.3 T细胞TCR转基因技术

　　双刃剑 针对T细胞克隆筛选的问题，研究者已通过利用基因转移表达高亲和力的转基因TCRα和β链或表达合成嵌合抗原受体克服了这一局限。TCR的α和β链的cDNAs已从对肿瘤起反应的细胞毒性T细胞的Ⅰ类HLA限制的TCRs克隆得到，并用整合X体转移到新的T细胞中，赋予受体细胞与供体T细胞同样的抗原特异性。这种方法适用于大量肿瘤抗原特异T细胞的快速生产［19，21，24-28］。

　　目前许多肿瘤特异性TCR基因已被分离鉴定，包括针对恶性肿瘤中过表达的正常蛋白，例如p53或是癌胚抗原；差异化抗原，比如被T细胞受体-1（MART-1）或肿瘤特异性抗原受体（CTA）家族成员所识别的恶性黑素瘤抗原等。当然，转基因TCR存在一些问题：首先，转基因TCR链可能与来自患者的内生TCR链发生错配，从而导致细胞表面肿瘤反应性TCR密度减少，同时这种错配还可能产生移植物抗宿主病，尽管研究者用R晕Ai干扰内源性受体基因表达或用2A序列稳定α和β表达比例等的方法以期实现功能型的配对；其次，因为TCR只识别MHC分子提呈的肽段抗原，而不同患者的MHC分子不同，所以必须分离对所有MHC单体型特异的TCR，这在实践中难以实现；再次，TCR结合的抗原多为蛋白肽段，不能识别糖类与糖脂类抗原，抗原范围局限性大。

　　嵌合抗原受体的出现，使T细胞可通过非MHC限制性途径与肿瘤抗原发生反应。第一代嵌合抗原受体（ chimeric antigen receptors，CAR）由一个scFv（由抗体VL区氨基酸序列和VH区序列经肽连接物连接而成）通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE高亲和受体的跨膜和胞内信号结构连接构成，表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。此外，与常规的TCR只能针对蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，还包括糖类和糖脂类肿瘤相关抗原，而这些抗原不像蛋白抗原那么容易突变。然而，表达CAR的T细胞只具有效应功能，体内存留时间短。为此，第二代CAR在第一代CAR的基础上，增加了刺激结构域，可以接受来源于抗原提呈细胞表面的CD28和CD80的共刺激，延长T细胞在体内存活时间。但是，不依赖MHC的靶标识别途径有其潜在的问题。抗原加工并与MHC结合后能够使细胞内的抗原分子提呈到细胞表面，然而表达嵌合抗原受体的T细胞没有MHC的帮助，仅能识别存在于肿瘤细胞表面的抗原分子，对于肿瘤细胞内抗原分子必须由具有新肿瘤抗原分子识别受体的T细胞发挥作用。

　　通过TCR或CAR转基因技术虽然可使肿瘤抗原特异性T细胞快速达到期望数量，然而这一技术也存在一些问题。首先，获得的T细胞克隆为均质细胞，只能识别单一的肿瘤抗原。但肿瘤异质性高，单一靶向的T细胞能特异杀伤一类肿瘤细胞，不携带该抗原分子的肿瘤细胞则可被豁免。而且，肿瘤可以通过自身的进化，丢失被T细胞识别的肿瘤变异抗原，逃逸这类T细胞的免疫作用。其次，该T细胞克隆具有在宿主体内持续存在、大量增殖的潜力，可能产生T细胞的瀑布效应，过量激活导致对自身器官的攻击，这是我们需要预防的。针对这个问题，很多研究者采用TK自杀基因在适当的时候对那些过量的T细胞进行自我毁灭［29］；这个方法在其他华体会手机娱乐 的方案中已经比较成熟，已进入Ⅲ期临床试验。也可用可诱导的caspase9（icasp9），icasp9是caspase凋亡途径中天然存在的成分，无免疫原性且不会在处于静止期的细胞内引发凋亡，目前该方法已开始临床试验［30-31］。

　　2.4 武装化T细胞

　　增强ACT抗癌疗效的利刃   肿瘤局部区域非成熟DC（iDC）、不成熟的骨髓来源细胞（iMC）、调控T细胞（Tregs）的数量上升，这类细胞对免疫起抑制作用，保护肿瘤细胞免受T细胞的伤害。肿瘤细胞还可通过旁分泌作用，使周围TGF-β水平显著上升，促进肿瘤的发展进程、侵袭性以及代谢功能，并可诱导T效应细胞生长阻滞，直接抑制T细胞的细胞毒作用。另外，肿瘤细胞大量分泌IL-10也会起抑制免疫效应。这类细胞可限制回输的T细胞在肿瘤病灶内发挥治疗作用，这也是早期肿瘤ACT归于失败的重要原因。采用化疗药剂，如环磷酰胺对患者进行预处理，可有效减少肿瘤局部免疫抑制细胞的数量，提高过继细胞治疗的效果［3，9-12，21］。但化疗药剂毒性较大，许多高龄或重危患者身体条件不允许。因而，为提高肿瘤ACT治疗的疗效，尽量减少化疗药剂的使用，需赋予T细胞更多的抗癌机制。

　　目前，采用的策略主要包括：

　　（1）使T细胞表达IL-2、IL-7和IL-15等促进免疫作用的淋巴因子，使肿瘤局部的该类淋巴因子浓度升高，模拟淋巴再生和动态平衡重建时的环境条件，使肿瘤微环境适宜于T细胞存活并发挥作用；

　　（2）通过基因工程的方法，如RNAi技术，使T细胞表面TGF-β受体下调，屏蔽肿瘤微环境中大量存在的TGF-β信号对其的抑制作用；

　　（3）使T细胞表达延长体内存活时间的基因，如端粒酶、抗凋亡基因Bcl-2等［32］。

　　目前转染T细胞X体多为慢病毒和逆转录病毒等整合性病毒，这类病毒随机插入T细胞基因组，可能会引起某些未知肿瘤基因及其他疾病基因的激活，带来了安全隐患。笔者实验室与上海白泽生物技术公司合作开展非整合病毒载体的研究。天然存在的腺病毒及腺相关病毒（AAV）载体对于T细胞等免疫细胞的感染能力有限，笔者通过对腺病毒纤毛蛋白及AAV外壳的改造，大幅提高重组腺病毒及腺相关病毒对T细胞的感染效率，弥补这两种病毒对T细胞感染效率低的缺陷；同时为解决腺病毒（Ad）表达时间较短而AAV表达起始较慢的问题，我们建立了Ad/AAV复合病毒系统来实现T细胞长期快速表达目的基因的目的。

　　在目的基因方面，笔者实验室应用前期建立的全长抗体基因治疗系统，在T细胞及CIK细胞中效果很好表达各种抗肿瘤抗体，如EGFR单抗、VEGF单抗、Her2单抗等，利用肿瘤特异性T细胞或CIK细胞趋化肿瘤的特性，提高肿瘤局部抗体的浓度，解决了全长抗体难以进入实体瘤内部的难题。同时这种T细胞及CIK细胞既能直接杀伤肿瘤细胞又能通过抗体依赖的细胞毒作用（即ADCC效应）发挥抗肿瘤作用，从而能够很大限度地实现细胞及抗体协同抗华体会手机娱乐 ［33］。

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　　2.5 肿瘤ACT疗效评判标准：

　　新的规则   作为免疫治疗的一种，ACT所产生的抗肿瘤活性是通过诱导肿瘤专一的免疫反应或通过改变患者的免疫进程来实现的，所产生的临床效应与传统的细胞毒药物治疗所产生的临床效应结果存在较多差异。对于细胞毒性药物来说，“ 临床疗效标准”认为，肿瘤生长的早期增加，或者新损伤的出现即意味着疾病恶化，也就意味药物试验失败。而在实际应用中，肿瘤ACT发挥疗效，但可能出现下面几种情况：

　　（1）肿瘤的收缩；

　　（2）持久稳定的疾病状态（有些患者有缓慢的总体肿瘤负荷的减小）；

　　（3）在总体肿瘤负荷v加后才起疗效；

　　（4）有新的损伤出现的情况下仍有疗效。

　　（5）出现混合反应现象，既有某些部位肿瘤消退，另一些部位没什么变化，而有的部位恶化。后面4种临床反应表现，按传统的评价标准都会被认为是疾病进展（PD），将停止治疗，但实际情况是出现这些情况患者都获得了有效生存延长。

　　因此，世界卫生组织（WHO）的评价标准或实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteriain solid tumors，RECST）可能无法有效合理评判由免疫治疗所产生的临床反应。为此，近期世界肿瘤疫苗协作组（Cancer Vaccine Consortium Group）与国际肿瘤生物治疗协会（International Society of Biological Therapy of Cancer）组织大约200名肿瘤学家、免疫治疗学家及临床药监专家，集中讨论了他们在对肿瘤患者实施免疫治疗后的一些经验，形成了一个“免疫相关反应评价标准（immune-related response criteria，irRC）”［34］。

　　新irRC规则表明

　　（1）明显可测的抗肿瘤活性，免疫治疗要比细胞毒性治疗需要更久的时间；

　　（2）免疫治疗有效反应可能会出现在传统PD之后；

　　（3）中断免疫治疗在一些情况下是不合适的，除非能确证是PD；

　　（4）PD被建议改为临床无显著性疗效；

　　（5）持久疾病稳定（SD）或许表明抗肿瘤疗效。irRC规则虽然是基于ipilimumab单抗的临床试验制定的，然而规则理念是来自于多个免疫治疗机构观察不同免疫制剂临床试验后所得出的一致结论，因此，irRC规则也被认为能广泛应用于其他免疫治疗试剂。这个新的评价体系的出台可能对今后免疫治疗药物和免疫治疗技术的开发产生积极的影响，当然这仍有待药监系统的深入理解并制定相应的药物审评标准。

　　3 结 语   

　　肿瘤的ACT治疗在经历了长期的低迷状态后逐渐重回到人们的视野中心，较近临床试验的成功以及肿瘤疫苗的上市重燃了人们对ACT的信心。越来越多的证据表明，ACT具有其他治疗方式无法比拟的优越性，是治疗恶性实体肿瘤的有效手段之一，具有十分广阔和诱人的临床应用前景。理想的肿瘤ACT，需要效果很好快速的T细胞体外筛选扩增技术，需要T细胞靶向多个肿瘤靶点，需要T细胞具有复合抗癌机制，需要T细胞能在体内长期存活，需要T细胞的体内增殖能得到有效调控。这些问题的解决，需要更多的探索及更多新技术的不断涌现。我们有理由相信，在不久的将来ACT将会在华体会手机娱乐 中获得更大的成功并真正成为肿瘤的个性化治疗手段，终将为大量肿瘤患者带来福音。

　　钱其军，博士、研究员、博士生导师，第二军医大学东方肝胆外科医院基因-病毒治疗实验室主任，浙江省基因治疗中心常务副主任；国家杰出青年基金获得者，上海市科技领军人才及优秀学科带头人；中国医药生物技术协会医药生物技术临床应用专业委员会常务委员，中国抗癌协会肿瘤生物治疗专业委员会委员；中华肿瘤杂志、中国肿瘤生物治疗杂志、癌症等杂志编委。主要从事肿瘤的基因-病毒治疗及免疫细胞过继治疗方面的研究。作为负责人承担国家杰出青年基金项目1项、国家自然科学基金国际合作重大项目1项、国家自然科学基金重点项目1项、国家自然科学基金海外杰出青年项目1项（ 国内负责人）、国家自然科学基金面上项目3项、国家863项目2项及艾滋病和病毒肝炎等重大传染病防治重点专项子项目1项。近年来荣获省部级奖项5项，在Cancer Res、Clin Cancer Res、Mol Ther、Plos One等杂志发表SCI-E论文40余篇，获授权中国发明专利6项、美国发明专利1项。

　　吴孟超，国际著名肝胆外科专家，中国肝脏外科的开拓者和主要创始人之一，中国科学院院士，主任医师、教授、临床医学博士后流动站导师，2005年度国家很高科学技术奖获得者。现任第二军医大学东方肝胆外科医院院长、东方肝胆外科研究所所长，兼任中德医学协会副理事长、全国医学专业学位教育指导委员会副主任、 医学科学技术委员会副主任、 总后勤部专家组副组长、中日消化道外科学顾问等职。擅长肝胆疾病的各种外科手术治疗，尤其擅长肝癌、肝血管瘤等疾病的外科手术治疗。从医50余年来，先后获各类医学科技成果奖项24项，发表论文220余篇，出版医学专著18部。1996年1月被授予“模范医学专家”荣誉称号。先后获得何梁何利医学基金奖、全国百名优秀医生奖、全国“侨界十杰”荣誉称号、全军科技重大贡献奖等荣誉。

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