生物治疗新模式：分子靶向原过继性细胞免疫治疗

　　肿瘤生物治疗的新模式：分子靶向原过继性细胞免疫治疗

　　作者：黄宇贤，郭坤元

  　 来源：中国肿瘤生物治疗杂志

　［摘要］分子靶向-过继性细胞免疫治疗是分子靶向药物和过继性细胞免疫疗法有机结合的新治疗模式，该模式建立在NK细胞活化性信号通路（NKG2D-NKG2DLs）的生物学特性，尤其是受配体可调控性的理论基础之上。分子靶向药物在其中扮演双重角色，除了药物本身对肿瘤细胞的毒性作用外，还作为“刺激诱导”4，诱导肿瘤细胞表达免疫激活物NKG2DLs（natural killer group 2memeber D ligands），与NK细胞表面NKG2D（natural killer group 2 member D）结合，激活NK细胞的杀伤活性。NKG2D与NKG2DLs是NK细胞主要的活化性受、配体，在机体抗肿瘤免疫中起重要作用。NKG2D主要表达于NK、CD8+T、γδT和活化的巨噬细胞，参与适应性及固有性免疫应答。与NKG2DL结合的配体（ NKG2DLs）广泛低表达于多种肿瘤细胞，而在正常组织细胞几乎未见表达，靶细胞的NKG2DLs表达水平直接关系到免疫效应细胞（ NK、DC、CTL细胞等）对其的杀伤活性。NKG2DLs的转录与表达可受多种因素影响，分子靶向药物可以诱导肿瘤细胞高表达NKG2DLs，NK细胞对高表达NKG2DLs的肿瘤细胞有较高杀伤活性，而对正常组织无杀伤作用，具有杀伤靶向性；NKG2DLs的高表达也增强了肿瘤细胞对其他免疫效应细胞的杀伤敏感性，具有良好的应用前景。分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗将使肿瘤患者获得更好的临床疗效，预示了肿瘤生物治疗新的发展方向———分子靶向原过继性细胞免疫治疗新模式的来临。

　　［关键词］分子靶向药物；过继性细胞免疫治疗；肿瘤生物治疗；NK细胞；NKG2D-NKG2DL

　　［中图分类号］R730.54；R730.51    ［文献标志码］A   ［文章编号］1007-385X（2010）03-0243-07

　　生物治疗是继传统手术、化疗、放疗之后又一类新兴的华体会手机娱乐 方法，其主要包括分子靶向治疗、过继性细胞免疫治疗、基因治疗、细胞因子、疫苗治疗等。分子靶向治疗以高度的肿瘤靶向性为依托，良好的机体耐受性是其巨大优势，尤其适用于治疗处于瓶颈阶段而一般状况又较差的耐药和复发性恶性肿瘤患者［1］。分子靶向治疗的临床有效性受多种因素影响，其对表达特异性靶点的肿瘤疗效虽佳却终将面临产生耐药性的问题［2］。过继性细胞免疫治疗杀伤机制不同于化学治疗，不存在耐药性问题，但不同个体间的疗效差异很大。NCI（ national cancer institute）统计显示，过继性细胞免疫治疗的有效率为7%~40［3］。建立一种科学的理论基础，作为分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗的桥梁，使这两种治疗方法能够优势互补、协同杀伤耐药或复发的肿瘤细胞，成为肿瘤生物治疗研究者迫切需要解决的问题。

　　NK细胞作为机体天然免疫的主要承担者，是过继性细胞免疫治疗的重要效应细胞。NK细胞发挥杀伤功能是建立在人类白细胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）-杀伤细胞免疫球蛋白（killer cell immunoglobulin-like receptor， KIR）错配的基础上［4］；同时，抑制性和活化性受、配体的平衡对NK细胞的杀伤活性也至关重要［5］。NKG2D（natural killer group 2 member D）是NK细胞主要的活化性受体，相应配体NKG2DLs（ NKG2D ligands）广泛低表达于多种肿瘤细胞，在正常组织细胞几乎未见表达，肿瘤细胞的NKG2DLs表达水平直接关系到免疫活性细胞的抗肿瘤活性［6］。另外，多种因子能调节肿瘤细胞上NKG2DLs的表达，增强肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性。本文以NK细胞活化性信号通路（NKG2D-NKG2DLs）的生物学特性为理论依据，分析分子靶向药物如何调控肿瘤细胞NKG2DLs的表达以实现对过继性细胞免疫治疗的增效作用，阐述生物治疗的新模式：分子靶向-过继细胞免疫治疗。

　　1 NKG2D-NKG2DLs活化性信号通路的生物学特性及作用

　　NK细胞发挥功能主要依赖其表面受体与靶细胞表面MHC（或非MNC）类配体的结合，传递活化性或抑制性信号，调节NK细胞的活性［7］。在众多NK细胞抑制性和活化性受配体当中，研究得较彻底的是HLA-KIR信号通路，该通路传递抑制性信号，抑制NK细胞的活性。另外一个是NKG2D-NKG2DLs信号通路，该通路传递活化性信号，激活NK细胞的杀伤活性［8-10］（表1）。

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　　NKG2D在NK细胞的表达率达90，是NK细胞主要的活化性信号分子［11］；也表达于其他免疫效应细胞上，如CD8+T、γδT、活化的巨噬细胞（表2）；参与适应性及固有性免疫应答，调节NK细胞、T细胞和树突状细胞的功能［12-13］。NKG2D作为免疫效应细胞的主要活化性受体，主要功能为：（1）作为活化性受体与NKG2DLs结合，激活NK细胞发挥杀伤功能；

　　（2）作为协同刺激分子传递第二信号，活化巨噬细胞和T细胞［14］。NK细胞活化性信号通路（ NKG2D-NKG2DLs）介导的杀伤活性强于HLA-KIR抑制性信号通路介导的抑制作用［15］。NK细胞杀伤功能的启动主要通过NKG2D与靶细胞表面NKG2DLs的结合，激活下游活化性信号通路发挥细胞毒作用，即NK细胞对靶细胞杀伤活性的高低取决于靶细胞NKG2DLs的表达水平［16］。

　
　　与NKG2D相结合的膜蛋白分子配体，即NKG2DLS，主要包括MHC-Ⅰ链相关分子A或B（MHC class Ⅰ-relatedchain molecules A/B， MICA/B）和人巨细胞病毒糖蛋白UL16结合蛋白（UL16-binding proteins，ULBPs）［17］。正常细胞一般不表达NKG2DLs，肠上皮细胞、呼吸道上皮和妊娠滋养层细胞仅少量表达NKG2DLs［18］。许多因素可以影响NKG2DLs的转录与表达，包括细胞的转化和恶变、药物刺激、放射损伤、离子辐射、细菌和病毒感染、细胞因子、生物毒素、植物单体（苦参碱、冬凌草甲素、姜黄素）和DNA损伤［19］。不同的刺激因素对NKG2DLs的诱导作用不同，同一种刺激因素在不同细胞可以诱导不同种类NKG2DLs的表达，不同刺激因素在同一细胞也可诱导不同种类NKG2DLs的表达。NKG2DLs的表达存在多样性，同一细胞可表达多种NKG2DLs，也可单独表达某种NKG2DL。

　　多种恶性肿瘤细胞低表达NKG2DLs，包括神经胶质瘤、白血病、恶性黑素瘤、成神经细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结华体会百家乐 及卵巢癌［20-22］。NKG2DLs在机体抗肿瘤免疫中扮演非常重要的角色，主要体现在下面几个方面［19］：（1）NKG2DLs介导免疫反应。NKG2DLs能激活表达NKG2D的NK细胞和CD8+T细胞，使其产生IFN-γ，增效果很强应细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，并通过穿孔素杀伤肿瘤细胞。

　　（2）肿瘤的逃逸作用。

　　NKG2DLs与内质网蛋白5（endoplasmic reticulum protein 5，ERp5）和从肿瘤细胞表面脱落的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）相互作用，使NKG2DLs表达下调或阻断肿瘤细胞NKG2DLs与免疫效应细胞的结合。

　　（3）免疫治疗作用。

　　许多刺激因素可诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs，增强免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。NKG2D-NKG2DLs介导抗肿瘤免疫的主要优势，表现在通过NK细胞受体和肿瘤细胞上配体的特异性结合，NK细胞仅杀伤高表达NKG2DLs的肿瘤细胞，体现杀伤的靶向性。

　　2 分子靶向药物调节肿瘤细胞NKG2DLS的表达

　　肿瘤细胞NKG2DLs的表达水平很大程度上决定了肿瘤细胞对机体NK细胞的杀伤敏感性，并且肿瘤细胞上NKG2DLs的表达可以受多种因素的调节。文献［23-25］报道及笔者研究［26-29］发现，分子靶向药物对肿瘤细胞NKG2DLs的表达具有诱导作用，且不同分子靶向药物对肿瘤细胞NKG2DLs表达的诱导作用不同，其中以酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼的诱导作用较强。分子靶向药物上调肿瘤细胞NKG2DLs表达的同时，肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性也随之增高。分子靶向药物除了诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs外，还具有下述生物学效应：（1）分子靶向药物作用于肿瘤细胞特异性靶点，如酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼通过抑制VEGFR、PDGFR、Kit和RET等酪氨酸激酶而阻断Raf/MEK/ERK信号通路，影响肿瘤细胞的增殖和转移。西妥昔单抗阻断肿瘤细胞表面的EGFR，间接诱导免疫效应细胞分泌IFN-γ，增强免疫效应细胞的ADCC（antibody dependent cell mediatedcytotxicity）效应［30］。Roda等［25］先利用西妥昔单抗“包被”乳腺癌、肺癌和胰腺癌细胞，再与NK细胞共孵育，NK细胞分泌IFN-γ的水平升高3~10倍，增强了NK细胞的ADCC效应。（2）分子靶向药物能直接抑制肿瘤细胞膜上转K蛋白的“药泵”，使抗肿瘤药物在靶细胞内聚集，逆转肿瘤细胞耐药。文献［31-33］报道，吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼等酪氨酸激酶受体抑制剂能抑制耐药乳腺癌细胞、小细胞肺癌细胞和人表皮样癌细胞上的多药耐药蛋白ABCB1、ABCG2的“ 药泵”作用，化疗药物不能被泵出细胞外，持续在细胞内聚集，增强化疗药物的疗效。另外，研究［34-35］发现，分子靶向药物上调耐药肿瘤细胞ERK蛋白的表达和活性，使耐药肿瘤细胞表面NKG2DLs的表达水平高于亲本细胞，增强耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。

　　3 分子靶向药物调控肿瘤细胞NKG2DLs表达的分子机制 

　　多种因素（包括分子靶向药物）能诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs，但其分子机制仍莫衷一是［36］。Gasser等［37］认为，DNA损伤修复反应诱导肿瘤细胞表达NKG2DLs。在低或高剂量化学药物的刺激下，细胞的DNA损伤反应可激活信号转导分子，如ATM或ATR激酶，这些激酶进一步活化下游的CHK1、CHK2激酶和凋亡相关分子，从而诱导NKG2DLs的表达。Weizman等［38］报道，激活蛋白1（active protein-1，AP-1）能联合DNA损伤修复反应，上调NKG2DLs的表达。NKG2DLs基因启动子中含有多种转录因子的结合位点，包括活化转录因子6（activation transcription factor 6，ATF6）、热休克转录因子1（heat shocktranscriptionfactor1，HSF1）、髓样锌指因子1（myeloid zinc finger 1，MzF1）、碱性核蛋白（basonuclin，BNC）和NF-κB等转录因子的结合位点，这些结合位点在不同条件下与相应的转录因子结合，调节NKG2DLs的表达［39］。多位学者等［40-41］认为，DNA损伤修复反应可通过激活下游NF-κB调节NKG2DLs的表达。

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　　综合目前调控NKG2DLs表达分子机制的相关文献和笔者的实验结果，笔者认为，对于分子靶向药物诱导NKG2DLs表达的分子机制，倾向于多重分子机制间协同调控NKG2DLs表达的理论（图1）。分子靶向药物特异性阻断了肿瘤细胞的特异性靶点和相关的信号通路，而这些靶点和信号通路与调节NKG2DLs表达的关键信号分子间存在相互作用，共同调节NKG2DLs的表达。药物除具有细胞毒作用外，本身也是一种刺激源，可通过DNA损伤修复反应或其他信号通路调节NKG2DLs的表达。而且，NKG2DLs表达的多样性决定了调控机制的多样性，使机体对不同刺激因素、不同环境作出适当的应答。笔者在探讨分子靶向药物诱导肿瘤细胞NKG2DLs表达的研究中发现，未处理的肿瘤细胞不能扩增出NF-κB mRNA，但经分子靶向药物舒尼替尼处理之后可扩增出NF-κB mRNA和P53 mRNA片段，并且肿瘤细胞中5种NKG2DLs的表达水平都明显上调，对NK细胞杀伤的敏感性也明显增强，提示NF-κB对NKG2DLs的表达具有调节作用。


　　（1）分子靶向药物固有作用：分子靶向药物作用于肿瘤靶细胞后，抑制了肿瘤细胞的特异性靶点（如西妥昔单抗与EG-FR结合、贝伐单抗与VEGFR结合）和相关的信号通路（Ras/Raf-MAPK、PI3K-AKT等信号通路），抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性；（2）分子靶向药物可通过激活NF-κB、AP-1、GSK-3（gpycogen synthase kinase-3）等信号分子诱导NKG2DLs的表达；（3）分子靶向药物作用肿瘤细胞后，作为一种“刺激诱导”源，引起细胞DNA损伤反应，通过DNA损伤相关信号分子（如ATM/ATR、CHK1/CHK2等）诱导NKG2DLs的表达。

　　4 NKG2D和NKG2DLs表达对过继性细胞免疫治疗疗效的预测作用 

　　目前，仍未有一种有效的方法能够预测过继性细胞免疫治疗的疗效，导致了过继性细胞免疫治疗的盲目性，因此，疗效预测方法的建立对过继性细胞治疗的规范化具有重要意义。过继性细胞免疫治疗的疗效取决于两个方面，一方面是过继性免疫细胞的质和量，另一方面是肿瘤组织的情况（包括肿瘤类型、瘤块大小、病理类型及免疫分子表型等）。

　　过继性免疫细胞的量，可以通过优化制备条件来获得更多的过继性免疫细胞。过继性免疫细胞的质主要是指细胞的功能状态。免疫效应细胞发挥杀伤作用是免疫活化性和抑制性受配体共同作用的结果。NKG2D是免疫效应细胞重要活化性受体，NKG2D在免疫效应细胞中表达水平越高，其杀伤活性越强［42］。在CIK、NK细胞制备过程中，随着培养时间延长，NKG2D表达水平增高，CD3+ CD56+ CIK细胞中NKG2D表达率达98%，CD3- CD56+ CIK细胞中NKG2D表达率达76%；同时CIK、NK细胞低表达其他非MHC依赖性的NK细胞激活受体，如NKp30（18%）、NKp44（10%）和NKp46（18%）；无或弱表达抑制性受体，如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR3DL1、NKG2A和CD94。细胞成熟程度越高，其NKG2D表达水平越高，对K562细胞的杀伤活性越强［11］。因此，过继性细胞免疫治疗中，NKG2D可能是反映CIK、NK细胞成熟程度和功能状态的一个非常重要的指标，可预测CIK、NK细胞的疗效。

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　　从肿瘤组织方面分析，决定肿瘤细胞对免疫效应细胞杀伤敏感性的是HLA-KIR的错配程度以及活化性配体的表达水平。HLA-KIR错配方面，自体CIK、NK细胞治疗不存在HLA-KIR错配；异体CIK、NK细胞治疗多数有HLA-KIR错配，但由于检测方法复杂，临床较难推广。活化性配体的表达方面，NKG2DLs是免疫细胞重要的活化性配体，广泛表达于多数肿瘤组织。高表达NKG2DLs的肿瘤细胞对免疫效应细胞杀伤的敏感性高，低表达NKG2DLs的肿瘤细胞对免疫效应细胞杀伤的敏感性低。此外，NKG2DLs在肿瘤组织中的表达水平与疾病预后密切相关。NKG2DLs高表达结肠癌患者比低表达NKG2DLs结肠癌患者的中位生存期、疾病进展时间和总生存期延长；另外，NKG2DLs表达水平较高的肿瘤患者，其肿瘤TNM分期好于NKG2DLs表达水平较低的肿瘤患者［35］。因此，检测肿瘤组织中NKG2DLs表达水平具有重要意义。临床中有望通过免疫组化的方法检测肿瘤组织中NKG2DLs的表达水平，由此预测CIK、NK细胞治疗的疗效。本课题组已经利用此技术平台开展过继性细胞免疫治疗的疗效预测，但目前收集的病例样本仍较少。

　　5 如何实现肿瘤的分子靶向原过继性细胞免疫治疗新模式 

　　肿瘤的发生、发展是一个动态演变的复杂过程，其中，肿瘤细胞—肿瘤干细胞—肿瘤细胞相互之间的转化给华体会手机娱乐 带来了困难，化疗失败的主要原因是肿瘤干细胞的存在和肿瘤细胞的多药耐药［43］。分子靶向药物治疗联合过继性细胞免疫治疗具有协同作用，其杀伤肿瘤细胞的机制不同于细胞毒性药物，主要通过主动或被动的方式激活机体的免疫应答来杀伤肿瘤细胞，适合对化学药物耐药的肿瘤患者，这种治疗新模式是华体会手机娱乐 的发展趋势。

　　免疫效应细胞发挥功能首先需要激活，靶细胞表面活化性配体的表达对免疫效应细胞的激活十分重要，多种因素可以调控活化性配体的表达水平。以免疫效应细胞活化性受配体生物学功能和受配体可控性表达为纽带将分子靶向药物与过继性细胞免疫治疗（例如NK细胞）联合起来，通过分子靶向药物调节活化性配体的表达，增强免疫效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。本课题组前期研究发现，NKG2D和NKG2DLs表达水平与NK细胞对肿瘤细胞的杀伤存在良好的线性关系，NKG2D反映了NK细胞的功能状态，NKG2DLs反映了肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性。在目前过继性细胞免疫治疗没有理想的疗效预测指标的前提下，NKG2D-NKG2DLs信号分子的表达水平可能是较好的疗效预测指标。

　　分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗（NK细胞）适合于肿瘤早期术后的患者、化学药物治疗抵抗的肿瘤患者、体质弱的晚期肿瘤患者、老年肿瘤患者。实施靶向-过继性细胞免疫治疗步骤如下：（1）治疗前应检测不同类型肿瘤细胞表面分子靶向药物靶点表达的情况，如EGFR、VEGF、Her2、CD20和BCR-ABL等。根据肿瘤细胞表达的靶点选择相应的分子靶向药物。（2）评估患者免疫状态，如采用流式细胞术检测患者淋巴细胞亚群、免疫效应细胞表面NKG2D的表达水平等。（3）预测肿瘤患者对过继性细胞免疫治疗的敏感性。实体肿瘤患者可用免疫组化法检测肿瘤组织中NKG2DLs的表达水平，血液肿瘤患者可用流式细胞术检测肿瘤细胞NKG2DLs的表达水平。（4）联合使用分子靶向药物和过继性细胞免疫治疗（如NK细胞、CIK细胞或DC-CIK细胞输注），两个疗程后进行疗效评价。

　　分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗是一种新兴华体会手机娱乐 模式，其治疗效果如何仍是未知数。多位学者［44-47］发现，进展期黑素瘤患者应用分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗可取得比单药更好的疗效，主要原因是多数恶性肿瘤细胞中，Ras/Raf/MEK/ERK、Akt/PI3K、mTOR等信号通路活性异常增高，而分子靶向药物（如索拉非尼、舒尼替尼等多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂，蛋白酶体抑制剂，抗血管生成药物）联合过继性细胞免疫治疗可抑制肿瘤细胞中这些信号通路的表达，下调肿瘤细胞抗凋亡蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。但临床应用是否具有良好的疗效，需要大量临床病例的验证。

　　6 展望

　　NKG2D-NKG2DLs活化性信号通路在抗肿瘤免疫反应中的重要性不容置疑。分子靶向药物除了药物本身对肿瘤细胞的细胞毒作用外，还可以通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2DLs，增强肿瘤细胞对免疫效应细胞杀伤的敏感性。这种由NKG2D-NKG2DLs介导的分子靶向药物对肿瘤细胞的免疫调节作用，揭示分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗可以实现1+1>2的协同效应，将给肿瘤患者带来更显著的临床效果，也预示了肿瘤生物治疗新的发展方向——分子靶向-过继性细胞免疫治疗新模式的来临。当然，靶向-过继性细胞免疫治疗是近年来刚刚兴起的华体会手机娱乐 模式，其理论基础、分子机制、临床疗效以及相关疗效的预测还有待进一步深入研究。大部分肿瘤患者在经过手术、化疗、放疗之后才考虑进行生物治疗，此时可能已错过了治疗的优等时机；此外，分子靶向治疗和过继性细胞免疫治疗费用较高也成为分子靶向原过继性细胞免疫治疗实施的障碍之一。

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