急性髓细胞性白血病DCIK细胞治疗疗效观察
来源：国肿瘤生物治疗杂志
时间：2012/02/14 10:21
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急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是起源于造血干细胞的恶性疾病，在临床上除了化疗外，以造血干细胞移植为主要的治疗手段。目前，过继性免疫治疗用于AML的强化治疗及难治、复发性病例诱导缓解治疗在临床上取得了较好疗效［1］。
过继性免疫疗法中，细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）兼具栽淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，成为增殖能力和细胞毒活性较强的肿瘤免疫效应细胞。
研究表明［2］，CIK与DC细胞共培养可以诱生以CD3+ CD56+（natural killer T cell，NKT）表型为主的DCIK细胞群，可以获得更高的抗肿瘤效果。本课题组前期研究也证实DCIK细胞的细胞毒活性明显大于CIK细胞［3］，在体外肿瘤细胞杀伤和体内小鼠肿瘤模型治疗中都取得了良好的抗肿瘤效果［4］。本研究采集AML患者外周血，分离出单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），经体外诱导培养成鉴定合格的DCIK细胞后，回输给AML患者进行过继性免疫治疗，取得了良好的临床治疗效果。
研究对象
10例AML患者均为2006年1月至2007年12月苏州大学附属第一医院所收治，其中男8例，女2例，中位年龄为37（13~52）岁。按FAB分类法分型，M2为6例，M4为2例，M5为2例。
入组标准：经临床及骨髓细胞形态学、细胞学染色和组织化学检测而确诊为急性髓细胞性白血病；接受过白血病的常规化疗后处于缓解中；末次治疗至开始接受DCIK治疗的间隔时间为4周；KPS评分≥80分。本研究获苏州大学附属第一医院伦理学委员会的批准，所有患者或其法定代理人签署了知情同意书，同意进行此免疫抗华体会手机娱乐 。
排除标准：正在接受放疗、化疗或其他全身抗华体会手机娱乐 者；同时存在其他恶性肿瘤及传染性疾病者；怀孕期或哺乳期妇女；存在违反本试验的体检或实验室检测异常者。
主要试剂来源
人红白血病细胞株K562由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供。AIM-V培养基购自GIBCO公司，IFN-γ为上海生物制品研究所提供，则rhIL-2由上海华新生物技术公司提供，则rhIL-4由Amoytop Biotech提供，rhGM-CSF由复旦大学附属华山医院提供，TNF-α由上海塞达生物药业有限公司提供，rh-IL-1β由晶美生物工程有限公司提供，αCD3由Yes生物技术公司提供，淋巴细胞分离液由上海试剂二厂提供，硫酸庆大霉素由上海第一制药厂提供，人血清白蛋白为上海生物制品所提供。
DC和CIK细胞的体外培养
用血细胞分离仪采集AML患者外周血，再用淋巴细胞分离液纯化后，得到PBMC100ml，约1×109个细胞。取PBMC细胞接种到AIM-V培养液，调节细胞密度为1×106/ml，加入IFN-γ1000 U/ml，培养2h。将非黏附细胞移入经抗αCD3单抗包被的100 ml培养瓶中，添加rh-IL-1β和rhIL-2，使两者质量浓度分别为100、300 U/ml，培养2 d；用CIK液稀释至1×106/ml继续培养，2 d计数1次并传代；在留有黏附细胞培养瓶中，加入DC培养液培养5 d，加入TNF-α使其达200 U/ml，培养7 d，相差显微镜与电镜中观察其细胞形态。
体外诱导DCIK细胞
将培养7d的DC与CIK细胞1:5混合，按5×105/ml的密度继续培养10 d左右，收集DCIK细胞，加入2g人血清白蛋白，置于200ml 0.9% NaCl中备用。
1.5 DC、DCIK细胞形态观察 取DC（ 密度约1×105/ml），PBS洗涤2次，1000×g离心10min，PBS重悬，加样于多聚赖氨酸包被玻片，静置10min；PBS轻洗玻片，95%乙醇固定15min；PBS浸洗1min，苏木精染色6min；水浸洗，盐酸乙醇溶液分色5S，水浸洗，淡氨水细胞核蓝化4min；水浸洗，×红染液染色6min；水浸洗，梯度乙醇脱水；二甲苯透明，封片。另外，取已制备的DCIK细胞，用相差显微镜观察。
流式细胞术分析细胞表型
应用FITC标记的抗人CD分子单抗与淋巴细胞表面CD分子结合，流式细胞仪对DCIK在回输前进行CD3+ CD56+表型鉴定；在DCIK免疫治疗前后，抽取白血病患者外周血进行淋巴细胞CD3+、CD4+ 、CD8+ 、CD56+ 表型分析。
MTT法检测
DCIK细胞对K562细胞系的体外杀伤活性 DCIK细胞作为效应细胞，K562人红白血病细胞为靶细胞。将诱导培养13d的DCIK细胞（密度为4×106个/ml）与K562细胞按效靶比10:1、5:1、2.5:1分别加入96孔板中。每6孔为同一组效靶比，另设单独效应细胞组和单独靶细胞组为对照组， 37℃、5%CO2培养过夜。加入MTT液培养5 h，离心弃上清后加入酸化异丙醇完全溶解甲臜沉淀，较后测D570值。计算杀伤率：杀伤率（%）=1-［（ET-E）（/TC）］×接近满分，其中T为靶细胞，E为效应细胞，C为空白对照。
免疫治疗计划
患者在接受AAG等常规方案化疗后处于CR中，在完善治疗前经基线评估，然后取PMBC，制备DCIK，经鉴定其成活率达90%以上，无菌且无热原，体外较效果很好靶比时对肿瘤靶细胞的杀伤活性达50%以上。静脉回输鉴定合格的自体DCIK细胞，每次5×109个细胞，总体积为350~400ml。3d输注1次，每3次为1个疗程。本课题中所列白血病患者使用3个疗程，每个疗程间隔1个月。
疗效评价标准和临床观察指标
观察方法包括观察临床症状、体征，血象每周2次，骨髓象、中性粒细胞碱性磷酸酶（neutrophilic alkaline phosphatase ，NAP）每月1次，Ph染色体治疗前后各检查1次。肝肾功能、ECG、B超、心肌酶谱等检测±病情而定。
疗效评定标准：据1978年全国白血病防治协作会议附件［5］。完全缓解（complete remission，CR）：（1）临床：无贫血、出血、感染及白血病细胞浸润表现；（2）血象：血红蛋白＞100g/L，白细胞总数约10×104/L，分类无幼稚细胞，血小板（100~400）×109/L；（3）骨髓象：正常。持续完全缓解（ continuous completely remission，CCR）时间从CR时起计算至复发为止或继续CCR。免疫学评价：接受治疗后第8周，检测10例患者治疗后外周血中淋巴细胞CD3+、CD4+ 、CD8+ 、CD56+ 细胞的变化。
不良事件：±据美国国立癌症研究所制定的通用药物毒性反应标准，将各种不良事件分为O~Ⅳ度，Ⅰ度+Ⅱ度+Ⅲ度+Ⅳ度为毒性反应发生率。
随访：所有患者在疗效评价之后每3个月随访1次，行骨髓形态，微小残留病灶检测。
统计学处理
数据以X±S表示，采用t检验，应用统计软件OriginPro7.5完成。
下一页：免疫学疗效评价
DCIK细胞形态的变化
体外培养DC细胞H-E染色后进行细胞形态鉴定。由图1A可见细胞表面呈绒毛突起，且随诱导培养时间的延长突起明显，提示DC已经诱导成熟，可用于与CIK细胞的共培养阶段。
将DC与CIK以1:5混合共培养后在Nikon相差显微镜下观察，所诱导的DCIK细胞生长良好，细胞均匀透亮（图1B）。用碘化丙啶染色后经流式细胞术检测，细胞存活率均在90%以上，达到鉴定质量标准。
图1 体外诱导的DC与DCIK细胞（×400）
Fig.1 DC and DCIK cells cultured in vitro（×400）
A：H-E staining of dendritic cells ；B：DCIK cells2.2 DCIK细胞对K562白血病细胞的杀伤活性 MTT法检测结果显示，当DCIK细胞与K562细胞的效靶比为2.5:1时，杀伤率为（35.8±5.1）%；当效靶比为5:1时为（47.8±4.8）%；当效靶比为10:1时，达（ 58.3±3.3）%。结果显示，诱导的DCIK细胞体外杀伤肿瘤细胞效果明显。
DCIK细胞回输前表型分析
DCIK细胞群中具有效果很好杀伤活性的CD3+CD56+ 双阳性的NKT细胞。经体外培养合格的DCIK在回输给患者前，流式细胞术检测CD3+CD56+ 细胞比例，结果显示，回输给10例患者的DCIK细胞群中，表型为CD3+CD56+ 的细胞所占比例为（38.42±9.42）%，符合鉴定质量标准。
临床疗效评价
10位患者都完成3个疗程治疗，随访时间为16个月。结果显示，7例CCR，1例复发后缓解（second complete remission，CR2），1例复发后死亡，1例带瘤生存。
免疫学疗效评价
10例白血病患者回输DCIK进行免疫治疗前后，用FACS检测外周血中淋巴细胞的表型。在DCIK细胞治疗前后，CD4+ 平均百分率为35.52% VS 38.35%；CD8+ 平均百分率为21.54% VS 36.63%（P＜0.01）；CD3+中位百分率为75.26% VS 65.55%；CD56+ 平均百分率为11.83% VS 21.36%（P＜约0.05）。提示该疗法可使CD56+ 细胞明显升高，增强了杀伤肿瘤细胞活性；并且提高了患者体内的CD4+ 、CD8+ 基础水平，可诱导患者产生非特异性T细胞免疫反应。
治疗中发生的不良反应
在接受DCIK过继性免疫治疗的10例患者中未出现Ⅲ度和Ⅳ度的严重不良反应。
讨 论
CIK细胞是以CD3+CD56+ T细胞为主的异质细胞群，其抗瘤谱与LAK细胞相似。但CIK细胞在体内外杀肿瘤活性比LAK细胞强十倍以上，且体外增殖能力明显强于LAK细胞［6］。当CIK细胞受到敏感的靶细胞刺激时，CIK细胞通过其表面杀伤抑制受体系统或黏附分子对靶细胞的识别，释放穿孔素和胞质颗粒对靶细胞直接溶解，并能够分泌IFN、TNF、IL-2、TGF-β和GM-CSF等细胞因子，对靶细胞有直接或间接抑制与杀伤作用，进一步放大免疫杀瘤效应。CIK细胞亦可以增强Fas-L的表达，诱导表达Fas的肿瘤细胞发生凋亡。
CIK细胞在体内外都表现出较好的肿瘤杀伤作用。在SCID小鼠构建的人类B淋巴细胞瘤模型和原代慢性粒细胞白血病细胞接种SCID小鼠均证实CIK细胞具有抑制肿瘤细胞在体内种植、清除体内肿瘤、抑制肿瘤转移和延长小鼠生存期等作用［7］。
据报道，CIK细胞能抑制裸鼠移植瘤中73%卵巢癌细胞的生长［8］。另外，CIK细胞能抑制77%肺癌细胞NCI-H460在裸鼠中的生长［9］。
树突状细胞（Dendritic cell，DC）是目前发现的功能较强的抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），它通过处理、提呈抗原，介导机体免疫应答。DC与自然杀伤性细胞分别代表固有免疫系统中的两个不同角色。体内体外实验已经证明DC和NK之间存在互相作用，并产生不同的效应，包括DC和NK各自的活化、释放细胞因子以及各自的成熟等［10］。
较近MARTEN等［2］发现，DC与CIK细胞共培养后，两者互相作用，促进彼此的成熟。CIK细胞属于异质细胞群，随培养时间延长，其中CD3+CD56+ 细胞的含量逐渐升高，而CD45RA+细胞的含量逐渐减少；经DC作用后的CIK细胞中CD3+CD56+ 双阳性细胞和CD8+ 细胞的含量可进一步升高，CD45RA+细胞的含量进一步减少。说明大量成熟的DC进一步促进了CIK细胞的成熟。
另有研究［11］发现成熟的DC细胞可以刺激CIK细胞产生IFN-γ，但是CIK细胞反过来会通过穿孔素依赖的方式将不成熟的DC细胞杀死。
Schmidt等［12］证实，DC与CIK细胞通过共培养可降低CIK细胞群中的免疫抑制T细胞（Treg即CD4+ CD25+细胞）而达到削弱Treg对抗肿瘤免疫细胞的抑制作用，从而增强CIK在体内发挥细胞毒活性。另外，在体外观察到多发性骨髓瘤的独特型抗原刺激的DC与CIK细胞共同培养能明显提高CIK细胞的扩增和杀伤能力，间接说明肿瘤抗原可能具有诱导或激发CIK细胞扩增和杀伤活性［13］。
目前CIK细胞治疗肿瘤已进入Ⅰ~Ⅱ临床试验，比较有肯定疗效的肿瘤包括：血液肿瘤、泌尿与生殖系统肿瘤、神经胶质细胞瘤和消化系统肿瘤等。Leembuis等［14］曾报道9例自体造血干细胞移植后再复发的淋巴瘤患者接受悦陨运细胞治疗，3例接受高细胞量（中位数为9.4×109个CD3+细胞）的患者，2例患者获得部分缓解，且在治疗中未见明显的不良反应。在以化疗联合过继性免疫治疗肝癌中，将自体CIK细胞通过肝动脉输注给患者，与单纯化疗组相比，降低了肝癌患者的18个月的复发率达25%［15］。
DCIK作为CIK细胞的增强细胞，可为患者提供更佳的治疗效果。本课题组［16］同时进行的对肺癌治疗免疫治疗中，DCIK细胞也已经表现出较好的临床疗效，近期临床有效率达41.6%，中位无肿瘤进展时间可达17.5个月。为了检测DCIK对血液病肿瘤的临床疗效，本研究共收治10例确诊为急性髓细胞白血病的患者，接受自体DCIK输注治疗。研究中，经体外诱导的DC与CIK细胞共培养后，细胞群中CD3+CD56+ 的NKT细胞含量明显升高。
10例患者经过继免疫治疗后，7例患者在随访的16个月中得到持续缓解，CCR达70%；现有1例患者因复发而死亡；并且患者主观自我感觉也均有不同程度的改善。近期免疫学指标中，患者外周血中CD4+ 、CD56+ 、CD8+ 的比例均有明显升高，说明在DCIK静脉回输后，能有效诱导机体产生非特异性T细胞免疫反应。所有患者未发生严重不良反应。
总之，DCIK细胞制剂确实具有较高的肿瘤临床价值，可作为配合手术、放化疗治疗肿瘤的辅助手段，基本无不良作用，在防止肿瘤的转移和复发中发挥重要作用，并进一步提高肿瘤患者的生存率，改善他们的生活质量。（作者：石英俊，陈宇光，吴德沛，孙爱宁，吴涤梵，张尚权）
下一页：参考文献
［参考文献］
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［4］ 庄 捷，曹 晖，刘祥麟，等.树突状细胞与悦陨运细胞共培养诱生的阅悦悦陨运细胞群对肿瘤的杀伤作用［J］.细胞生物学杂志， 2007，29（2）：237-240。
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过继性免疫疗法中，细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）兼具栽淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，成为增殖能力和细胞毒活性较强的肿瘤免疫效应细胞。
研究表明［2］，CIK与DC细胞共培养可以诱生以CD3+ CD56+（natural killer T cell，NKT）表型为主的DCIK细胞群，可以获得更高的抗肿瘤效果。本课题组前期研究也证实DCIK细胞的细胞毒活性明显大于CIK细胞［3］，在体外肿瘤细胞杀伤和体内小鼠肿瘤模型治疗中都取得了良好的抗肿瘤效果［4］。本研究采集AML患者外周血，分离出单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），经体外诱导培养成鉴定合格的DCIK细胞后，回输给AML患者进行过继性免疫治疗，取得了良好的临床治疗效果。
研究对象
10例AML患者均为2006年1月至2007年12月苏州大学附属第一医院所收治，其中男8例，女2例，中位年龄为37（13~52）岁。按FAB分类法分型，M2为6例，M4为2例，M5为2例。
入组标准：经临床及骨髓细胞形态学、细胞学染色和组织化学检测而确诊为急性髓细胞性白血病；接受过白血病的常规化疗后处于缓解中；末次治疗至开始接受DCIK治疗的间隔时间为4周；KPS评分≥80分。本研究获苏州大学附属第一医院伦理学委员会的批准，所有患者或其法定代理人签署了知情同意书，同意进行此免疫抗华体会手机娱乐 。
排除标准：正在接受放疗、化疗或其他全身抗华体会手机娱乐 者；同时存在其他恶性肿瘤及传染性疾病者；怀孕期或哺乳期妇女；存在违反本试验的体检或实验室检测异常者。
主要试剂来源
人红白血病细胞株K562由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供。AIM-V培养基购自GIBCO公司，IFN-γ为上海生物制品研究所提供，则rhIL-2由上海华新生物技术公司提供，则rhIL-4由Amoytop Biotech提供，rhGM-CSF由复旦大学附属华山医院提供，TNF-α由上海塞达生物药业有限公司提供，rh-IL-1β由晶美生物工程有限公司提供，αCD3由Yes生物技术公司提供，淋巴细胞分离液由上海试剂二厂提供，硫酸庆大霉素由上海第一制药厂提供，人血清白蛋白为上海生物制品所提供。
DC和CIK细胞的体外培养
用血细胞分离仪采集AML患者外周血，再用淋巴细胞分离液纯化后，得到PBMC100ml，约1×109个细胞。取PBMC细胞接种到AIM-V培养液，调节细胞密度为1×106/ml，加入IFN-γ1000 U/ml，培养2h。将非黏附细胞移入经抗αCD3单抗包被的100 ml培养瓶中，添加rh-IL-1β和rhIL-2，使两者质量浓度分别为100、300 U/ml，培养2 d；用CIK液稀释至1×106/ml继续培养，2 d计数1次并传代；在留有黏附细胞培养瓶中，加入DC培养液培养5 d，加入TNF-α使其达200 U/ml，培养7 d，相差显微镜与电镜中观察其细胞形态。
体外诱导DCIK细胞
将培养7d的DC与CIK细胞1:5混合，按5×105/ml的密度继续培养10 d左右，收集DCIK细胞，加入2g人血清白蛋白，置于200ml 0.9% NaCl中备用。
1.5 DC、DCIK细胞形态观察 取DC（ 密度约1×105/ml），PBS洗涤2次，1000×g离心10min，PBS重悬，加样于多聚赖氨酸包被玻片，静置10min；PBS轻洗玻片，95%乙醇固定15min；PBS浸洗1min，苏木精染色6min；水浸洗，盐酸乙醇溶液分色5S，水浸洗，淡氨水细胞核蓝化4min；水浸洗，×红染液染色6min；水浸洗，梯度乙醇脱水；二甲苯透明，封片。另外，取已制备的DCIK细胞，用相差显微镜观察。
流式细胞术分析细胞表型
应用FITC标记的抗人CD分子单抗与淋巴细胞表面CD分子结合，流式细胞仪对DCIK在回输前进行CD3+ CD56+表型鉴定；在DCIK免疫治疗前后，抽取白血病患者外周血进行淋巴细胞CD3+、CD4+ 、CD8+ 、CD56+ 表型分析。
MTT法检测
DCIK细胞对K562细胞系的体外杀伤活性 DCIK细胞作为效应细胞，K562人红白血病细胞为靶细胞。将诱导培养13d的DCIK细胞（密度为4×106个/ml）与K562细胞按效靶比10:1、5:1、2.5:1分别加入96孔板中。每6孔为同一组效靶比，另设单独效应细胞组和单独靶细胞组为对照组， 37℃、5%CO2培养过夜。加入MTT液培养5 h，离心弃上清后加入酸化异丙醇完全溶解甲臜沉淀，较后测D570值。计算杀伤率：杀伤率（%）=1-［（ET-E）（/TC）］×接近满分，其中T为靶细胞，E为效应细胞，C为空白对照。
免疫治疗计划
患者在接受AAG等常规方案化疗后处于CR中，在完善治疗前经基线评估，然后取PMBC，制备DCIK，经鉴定其成活率达90%以上，无菌且无热原，体外较效果很好靶比时对肿瘤靶细胞的杀伤活性达50%以上。静脉回输鉴定合格的自体DCIK细胞，每次5×109个细胞，总体积为350~400ml。3d输注1次，每3次为1个疗程。本课题中所列白血病患者使用3个疗程，每个疗程间隔1个月。
疗效评价标准和临床观察指标
观察方法包括观察临床症状、体征，血象每周2次，骨髓象、中性粒细胞碱性磷酸酶（neutrophilic alkaline phosphatase ，NAP）每月1次，Ph染色体治疗前后各检查1次。肝肾功能、ECG、B超、心肌酶谱等检测±病情而定。
疗效评定标准：据1978年全国白血病防治协作会议附件［5］。完全缓解（complete remission，CR）：（1）临床：无贫血、出血、感染及白血病细胞浸润表现；（2）血象：血红蛋白＞100g/L，白细胞总数约10×104/L，分类无幼稚细胞，血小板（100~400）×109/L；（3）骨髓象：正常。持续完全缓解（ continuous completely remission，CCR）时间从CR时起计算至复发为止或继续CCR。免疫学评价：接受治疗后第8周，检测10例患者治疗后外周血中淋巴细胞CD3+、CD4+ 、CD8+ 、CD56+ 细胞的变化。
不良事件：±据美国国立癌症研究所制定的通用药物毒性反应标准，将各种不良事件分为O~Ⅳ度，Ⅰ度+Ⅱ度+Ⅲ度+Ⅳ度为毒性反应发生率。
随访：所有患者在疗效评价之后每3个月随访1次，行骨髓形态，微小残留病灶检测。
统计学处理
数据以X±S表示，采用t检验，应用统计软件OriginPro7.5完成。
下一页：免疫学疗效评价
DCIK细胞形态的变化
体外培养DC细胞H-E染色后进行细胞形态鉴定。由图1A可见细胞表面呈绒毛突起，且随诱导培养时间的延长突起明显，提示DC已经诱导成熟，可用于与CIK细胞的共培养阶段。
将DC与CIK以1:5混合共培养后在Nikon相差显微镜下观察，所诱导的DCIK细胞生长良好，细胞均匀透亮（图1B）。用碘化丙啶染色后经流式细胞术检测，细胞存活率均在90%以上，达到鉴定质量标准。
图1 体外诱导的DC与DCIK细胞（×400）
Fig.1 DC and DCIK cells cultured in vitro（×400）
A：H-E staining of dendritic cells ；B：DCIK cells2.2 DCIK细胞对K562白血病细胞的杀伤活性 MTT法检测结果显示，当DCIK细胞与K562细胞的效靶比为2.5:1时，杀伤率为（35.8±5.1）%；当效靶比为5:1时为（47.8±4.8）%；当效靶比为10:1时，达（ 58.3±3.3）%。结果显示，诱导的DCIK细胞体外杀伤肿瘤细胞效果明显。
DCIK细胞回输前表型分析
DCIK细胞群中具有效果很好杀伤活性的CD3+CD56+ 双阳性的NKT细胞。经体外培养合格的DCIK在回输给患者前，流式细胞术检测CD3+CD56+ 细胞比例，结果显示，回输给10例患者的DCIK细胞群中，表型为CD3+CD56+ 的细胞所占比例为（38.42±9.42）%，符合鉴定质量标准。
临床疗效评价
10位患者都完成3个疗程治疗，随访时间为16个月。结果显示，7例CCR，1例复发后缓解（second complete remission，CR2），1例复发后死亡，1例带瘤生存。
免疫学疗效评价
10例白血病患者回输DCIK进行免疫治疗前后，用FACS检测外周血中淋巴细胞的表型。在DCIK细胞治疗前后，CD4+ 平均百分率为35.52% VS 38.35%；CD8+ 平均百分率为21.54% VS 36.63%（P＜0.01）；CD3+中位百分率为75.26% VS 65.55%；CD56+ 平均百分率为11.83% VS 21.36%（P＜约0.05）。提示该疗法可使CD56+ 细胞明显升高，增强了杀伤肿瘤细胞活性；并且提高了患者体内的CD4+ 、CD8+ 基础水平，可诱导患者产生非特异性T细胞免疫反应。
治疗中发生的不良反应
在接受DCIK过继性免疫治疗的10例患者中未出现Ⅲ度和Ⅳ度的严重不良反应。
讨 论
CIK细胞是以CD3+CD56+ T细胞为主的异质细胞群，其抗瘤谱与LAK细胞相似。但CIK细胞在体内外杀肿瘤活性比LAK细胞强十倍以上，且体外增殖能力明显强于LAK细胞［6］。当CIK细胞受到敏感的靶细胞刺激时，CIK细胞通过其表面杀伤抑制受体系统或黏附分子对靶细胞的识别，释放穿孔素和胞质颗粒对靶细胞直接溶解，并能够分泌IFN、TNF、IL-2、TGF-β和GM-CSF等细胞因子，对靶细胞有直接或间接抑制与杀伤作用，进一步放大免疫杀瘤效应。CIK细胞亦可以增强Fas-L的表达，诱导表达Fas的肿瘤细胞发生凋亡。
CIK细胞在体内外都表现出较好的肿瘤杀伤作用。在SCID小鼠构建的人类B淋巴细胞瘤模型和原代慢性粒细胞白血病细胞接种SCID小鼠均证实CIK细胞具有抑制肿瘤细胞在体内种植、清除体内肿瘤、抑制肿瘤转移和延长小鼠生存期等作用［7］。
据报道，CIK细胞能抑制裸鼠移植瘤中73%卵巢癌细胞的生长［8］。另外，CIK细胞能抑制77%肺癌细胞NCI-H460在裸鼠中的生长［9］。
树突状细胞（Dendritic cell，DC）是目前发现的功能较强的抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），它通过处理、提呈抗原，介导机体免疫应答。DC与自然杀伤性细胞分别代表固有免疫系统中的两个不同角色。体内体外实验已经证明DC和NK之间存在互相作用，并产生不同的效应，包括DC和NK各自的活化、释放细胞因子以及各自的成熟等［10］。
较近MARTEN等［2］发现，DC与CIK细胞共培养后，两者互相作用，促进彼此的成熟。CIK细胞属于异质细胞群，随培养时间延长，其中CD3+CD56+ 细胞的含量逐渐升高，而CD45RA+细胞的含量逐渐减少；经DC作用后的CIK细胞中CD3+CD56+ 双阳性细胞和CD8+ 细胞的含量可进一步升高，CD45RA+细胞的含量进一步减少。说明大量成熟的DC进一步促进了CIK细胞的成熟。
另有研究［11］发现成熟的DC细胞可以刺激CIK细胞产生IFN-γ，但是CIK细胞反过来会通过穿孔素依赖的方式将不成熟的DC细胞杀死。
Schmidt等［12］证实，DC与CIK细胞通过共培养可降低CIK细胞群中的免疫抑制T细胞（Treg即CD4+ CD25+细胞）而达到削弱Treg对抗肿瘤免疫细胞的抑制作用，从而增强CIK在体内发挥细胞毒活性。另外，在体外观察到多发性骨髓瘤的独特型抗原刺激的DC与CIK细胞共同培养能明显提高CIK细胞的扩增和杀伤能力，间接说明肿瘤抗原可能具有诱导或激发CIK细胞扩增和杀伤活性［13］。
目前CIK细胞治疗肿瘤已进入Ⅰ~Ⅱ临床试验，比较有肯定疗效的肿瘤包括：血液肿瘤、泌尿与生殖系统肿瘤、神经胶质细胞瘤和消化系统肿瘤等。Leembuis等［14］曾报道9例自体造血干细胞移植后再复发的淋巴瘤患者接受悦陨运细胞治疗，3例接受高细胞量（中位数为9.4×109个CD3+细胞）的患者，2例患者获得部分缓解，且在治疗中未见明显的不良反应。在以化疗联合过继性免疫治疗肝癌中，将自体CIK细胞通过肝动脉输注给患者，与单纯化疗组相比，降低了肝癌患者的18个月的复发率达25%［15］。
DCIK作为CIK细胞的增强细胞，可为患者提供更佳的治疗效果。本课题组［16］同时进行的对肺癌治疗免疫治疗中，DCIK细胞也已经表现出较好的临床疗效，近期临床有效率达41.6%，中位无肿瘤进展时间可达17.5个月。为了检测DCIK对血液病肿瘤的临床疗效，本研究共收治10例确诊为急性髓细胞白血病的患者，接受自体DCIK输注治疗。研究中，经体外诱导的DC与CIK细胞共培养后，细胞群中CD3+CD56+ 的NKT细胞含量明显升高。
10例患者经过继免疫治疗后，7例患者在随访的16个月中得到持续缓解，CCR达70%；现有1例患者因复发而死亡；并且患者主观自我感觉也均有不同程度的改善。近期免疫学指标中，患者外周血中CD4+ 、CD56+ 、CD8+ 的比例均有明显升高，说明在DCIK静脉回输后，能有效诱导机体产生非特异性T细胞免疫反应。所有患者未发生严重不良反应。
总之，DCIK细胞制剂确实具有较高的肿瘤临床价值，可作为配合手术、放化疗治疗肿瘤的辅助手段，基本无不良作用，在防止肿瘤的转移和复发中发挥重要作用，并进一步提高肿瘤患者的生存率，改善他们的生活质量。（作者：石英俊，陈宇光，吴德沛，孙爱宁，吴涤梵，张尚权）
下一页：参考文献
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