PacBio第三代测序技术迎来创新性升级,准确度可与二代测序相媲美
前不久,作为三代测序技术的代表,牛津纳米孔(Oxford Nanopore)测序技术取得了突破性的进展,其新型R10芯片的发布使准确率大幅提升。点击链接,查看此前报道
现在,PacBio公司的第三代测序技术也迎来了重大升级,实现了能够与二代测序相媲美的准确度,相关成果发布在国际顶 级期刊Nature Biotechnology。这是PacBio对改进高准确度、长读长测序方法的又一次进步。
PacBio所采用的circular consensusse quencing(CCS)测序技术工作原理是在线性DNA分子的两端连接发夹接头(hairpinadapters),以创建一个“SMRTbell”模板。与接头结合的聚合酶可从接头移动,插入DNA链,并添加碱基、读取序列。CCS通过在接头多次移动产生高保真度(HiFi)reads,一直持续到聚合酶失活,产生同一DNA分子的多个pass。该平台在保证准确度的前提下,reads读取范围是1000~2000碱基。在较 新文章中,研究团队利用升级的CCS方法生成了超过10,000个碱基的reads。
Wenger博士解释道:“关键在于我们对CCS测序方法进行了技术创新,也就是“预扩展”(pre-extension)。”
CCS测序过程中,相互独立的聚合酶会不断结合核苷酸,直到失去活性。在这一过程中,聚合酶通常由于DNA受损等原因脱落,因此,PacBio测序系统受制于样本DNA质量。为解决这一问题,研究团队通过筛选未损坏的DNA分子,较 大限度地减少测序系统中受损DNA数量。在DNA样本加载到测序仪之前就开始进行测序反应,经过几个小时的延伸,如果聚合酶还可以继续“工作”,研究人员就可以判断DNA没有受损,并选择性的将DNA加载到测序仪,进行长读长测序。
此外,研究人员利用SageELF仪器确保选择的DNA分子大小相同,并确定预扩展的较 佳持续时间。这一创新性的设计是整个测序过程得以顺利实施的关键,有助于聚合酶在测序仪中长时间“工作”。
对于升级前的PacBio技术来说,其reads通常具有较高的错误率。但这些错误往往是随机的,如果对同一区域进行多次测序,平均误差就会被降低。在较 新研究中,研究团队证明,通过多次读取相同的DNA分子(平均10次)可以产生高质量的测序数据。同时,新的CCS测序方法产生的reads与Illumina的reads错误率大致相同,但比Illumina的reads长得多。
同时,研究团队发现,新CCS测序方法检测微小变异和结构变异的能力与短读长测序相当,甚至超过了短读长测序。几乎所有(99.64%)变体都可以被分类为单倍型,从而进一步改善变异检测。值得关注的是,单独使用CCS的reads进行从头基因组组装可以产生连续且准确的基因组,其contigN50超过15Mb,一致性为99.997%,基本优于已有长读长测序方法。同时,据研究人员估计,利用该测序方法可以纠正GIAB参考序列中的2,434个基因测序错误。此外,新方法有助于产生更加完整的基因组,以及分析所有基因区域的序列,包括短读长技术的低映射区域,且成本与当前的短读长测序相似。
是否还需要“polishing”?
polishing通常指将PacBio的长reads与Illumina的短reads相结合,将短reads覆盖在长reads上以对其进行polishing,或矫正错误位点。对此,Wenger博士做出了回应:“PacBio的新测序方法不需要polishing。这些reads的原始平均准确度为99.8%,与短reads的准确度相似。”
作为二代测序技术的强劲对手,第三代测序技术在近期所取得的一系列突破性进展,必将再次推动其在生命科学研究以及精 准医学等领域的普及应用!
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